Die standortgesteuerte Mutagenese ist nützlich, um molekulare Wechselwirkungen wie RNA-RNA und RNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt, wie standortgesteuerte Mutagenese mit einem zwei- oder dreistufigen PCR-Ansatz durchgeführt werden. Die Hauptvorteile der Methode sind die Vielfalt der verschiedenen Mutationen, die integriert werden können, sowie eine relative Leichtigkeit und Kosten dafür.
Verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage und die Primerpaare zwei, eins und zwei, drei, spezifisch für 2-Schritte- oder Primerpaare drei, eins und drei, vier, spezifisch für 3-Stufige PCR, um PCR-Produkt eins zu erhalten. Um PCR-Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese zu validieren, machen Sie ein 2%Agarose-Gel, indem Sie zwei Gramm Agarose in 100 Milliliter 1x TAE-Puffer mit einem Mikrowellenherd auflösen. Fügen Sie Ethidiumbromid bei einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.
Dann das Agarose-Gel gießen. Wenn Sie erstarrt sind, legen Sie es in eine Elektrophoreseeinheit. Laden Sie eine DNA-Leiter von bekannter Größe, und die PCR-Proben gemischt mit DNA-Ladefarbstoff in Brunnen.
Führen Sie Proben bei 75 Volt für 45 Minuten. Und visualisieren Sie Bänder auf einem UV-Transilluminator oder mit einem Gel-Bildgebungssystem. Als nächstes reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel-Extraktionskit nach dem Herstellerprotokoll und messen Sie die Konzentration der gereinigten DNA mit einem Spektralphotometer.
Dann lagern Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer. Um mit einer 2-stufigen PCR-Datei zu beginnen, verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage, dann paart die Grundierung zwei, eins und zwei, zwei, für fünf Primermutationen oder Primerpaare zwei, zwei und zwei, drei für drei Primentmutationen, um PCR-Produkt zwei zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben.
Verwenden Sie dann die Wild-Typ-DNA-Vorlage und das PCR-Produkt zwei als Primer, zusammen mit Primer zwei, drei für fünf Priment-Mutation, oder Primer zwei, eine für drei Priment-Mutation, um PCR-Produkt drei zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben. Dann speichern Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer.
Um die standortdirekte Mutagenese mit einer 3-stufigen PCR zu beginnen, verwenden Sie zunächst die Wildtyp-DNA-Vorlage und die Primerpaare drei, eins und drei, zwei, um PCR-Produkt zwei zu erhalten. Verwenden Sie die Wild-Typ-DNA-Vorlage und Primer-Paare drei, drei und drei, vier, um PCR-Produkt drei zu erhalten. Verwenden Sie die Wild-Typ-DNA-Vorlage und Primer-Paare drei, drei und drei, vier, um PCR-Produkt drei zu erhalten.
Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben. Schließlich verwenden Sie zwei bis fünf Nanogramm pcR-Produkte zwei und drei als Vorlage zusammen mit Primer-Paare drei, eins und drei, vier, um PCR-Produkt vier zu erhalten. Validieren Sie das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese, reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie seine Konzentration wie zuvor beschrieben.
Bewahren Sie die gereinigte DNA bei minus 20 Grad Celsius im TE-Puffer auf. In dieser Studie wurden 2-stufige und 3-stufige standortgesteuerte Mutagenese verwendet, um RNA-Wechselwirkungen in Bezug auf die posttranskriptionelle Regulation von CsgD zu untersuchen. Die Wild-Typ CsgD wurde PCR verstärkt, um PCR-Produkt IA zu erhalten, und der Wild-Typ mcaS wurde PCR verstärkt, um PCR-Produkt IB zu erhalten. Mit einer 3-stufigen PCR-Strategie wurden die PCR-Produkte IIA und IIIA in den ersten beiden Schritten und IVA im dritten Schritt zur Einführung von Mutationen in CsgD synthetisiert.
In ähnlicher Weise wurden in mcaS kostenlose standortgesteuerte Mutationen eingeführt, um pcR-Produkte IIB, IIIB in den ersten beiden Schritten und IVB im dritten Schritt zu erhalten. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression von Wildtyp mcaS zwar die Übersetzung von Wildtyp CsgD verhindert, Mutationen in mcaS oder CsgD jedoch die beobachtete Unterdrückung lindern. Mutationen in CsgD und mcaS verhindern jedoch die Übersetzung von CsgD.
Mit Einer zweistufigen PCR-Strategie wurden die PCR-Produkte IIC, IID, IIE, IIF und IIG im ersten Schritt synthetisiert, und die PCR-Produkte IIIC, IIID, IIIE, IIIF und IIIG wurden im zweiten Schritt zur Einführung von Mutationen in die gesamte CsgD-DNA synthetisiert. DIE EMSA-Ergebnisse der HFQ-Bindung an in vitro transkribierte CsgD-Wildtyp- und mutierte RNAs, die mit PCR-Produkten IIIC, IIID, IIIE, IIIF und IIIG synthetisiert wurden, zeigten die erhöhten KD-Werte der mutierten Allele. Dies bewies, dass HFQ weniger effizient an die Mutanten binden konnte.
Darüber hinaus hat HFQ mehrere Bindungsstellen auf CsgD, was durch die drei für die Wildtyp-RNA beobachteten Schichten gezeigt wird. Für unterschiedliche mutierte RNAs werden jedoch nur zwei Bindungsstellen beobachtet. Somit identifiziert der standortgesteuerte Mutationsansatz primäre und oder sekundäre Strukturen der CsgD mRNA, die für die vollständige Bindung von HFQ wichtig sind.
Die hier beschriebene Methode für die standortgesteuerte Mutagenese beruht auf PCR. Gute PCR-Praktiken sind daher entscheidend für die Methode und erfordern möglicherweise eine Optimierung, um erfolgreich zu sein. Die standortgesteuerte Mutagenese ist nur mit allen drei Methoden wie EMSA und Western Blotting leistungsfähig.
Andere Methoden umfassen z. B. verschiedene strukturelle Assays und einige Aktivitätstests sowie Studien zur Änderung von Übersetzungen.
