La mutagénesis dirigida por el sitio es útil para estudiar las interacciones moleculares, como el ARN-ARN, y las interacciones de proteínas de ARN. Este protocolo describe cómo realizar la mutagénesis dirigida por el sitio con un enfoque de PCR de dos o 3 pasos. Las principales ventajas del método son la diversidad de diferentes mutaciones que se pueden incorporar, así como una relativa facilidad y costo para hacerlo.
Para empezar, utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación dos, uno y dos, tres, específicos para pares de 2 pasos, o pares de imprimación tres, uno y tres, cuatro, específicos para PCR de 3 pasos para obtener el producto PCR uno. Para validar los productos de PCR mediante electroforesis de gel de agarosa, haga un gel de 2% de agarosa disolviendo dos gramos de agarosa en 100 mililitros de tampón 1X TAE, utilizando un horno microondas. Añadir bromuro de etidio a una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro.
Luego echa el gel de agarosa. Cuando se solidifice, colóquelo en una unidad de electroforesis. Cargue una escalera de ADN de tamaño conocido, y las muestras de PCR mezcladas con tinte de carga de ADN en pozos.
Ejecuta muestras a 75 voltios durante 45 minutos. Y visualice las bandas en un transiluminador UV o con un sistema de imágenes de gel. A continuación, purificar el producto PCR con un kit de extracción de gel según el protocolo de los fabricantes y medir la concentración del ADN purificado con un espectrofotómetro.
A continuación, almacene el ADN purificado en menos 20 grados centígrados en el tampón TE. Para comenzar la mutagénesis dirigida por el sitio con una PCR de 2 pasos, primero utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje, luego la imprimación empareja dos, uno y dos, dos, para cinco mutaciones de imprimación, o pares de imprimación dos, dos y dos, tres para tres mutaciones priment para obtener el producto PCR dos. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente.
A continuación, utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y el producto PCR dos como la imprimación, junto con la imprimación dos, tres para cinco mutaciones priment, o primera dos, una para tres mutaciones priment, para obtener el producto PCR tres. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente. A continuación, almacene el ADN purificado a menos 20 grados centígrados en el tampón TE.
Para comenzar la mutagénesis directa en el sitio con una PCR de 3 pasos, utilice primero la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, uno y tres, dos para obtener el producto PCR dos. Utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, tres y tres, cuatro, para obtener el producto PCR tres. Utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, tres y tres, cuatro, para obtener el producto PCR tres.
Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente. Por último, utilice dos a cinco nanogramos de productos de PCR dos y tres como plantilla junto con los pares de imprimación tres, uno y tres, cuatro, para obtener el producto PCR cuatro. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente.
Almacene el ADN purificado a menos 20 grados centígrados en el tampón TE. En este estudio, se utilizaron mutagénesis dirigida por el sitio de 2 y 3 pasos para investigar las interacciones de ARN con respecto a la regulación post transcripción de la CsgD. El CsgD de tipo salvaje fue PCR amplificado para producir PCR producto IA, y el tipo salvaje mcaS fue PCR amplificado para producir PCR producto IB. Utilizando una estrategia de PCR de 3 pasos, los productos de PCR IIA y IIIA se sintetizaron en los dos primeros pasos, e IVA en el tercer paso para introducir mutaciones en CsgD.
Del mismo modo, se introdujeron mutaciones gratuitas dirigidas al sitio en mcaS para producir productos de PCR IIB, IIIB, en los dos primeros pasos, y IVB en el tercer paso. El análisis de western blot mostró que si bien la expresión de mcaS de tipo salvaje impide la traducción de la CsgD de tipo salvaje, las mutaciones en mcaS o CsgD alivian la represión observada. Sin embargo, las mutaciones tanto en la CsgD como en la mcaS impiden la traducción de la ENFERMEDAD de Csg.
Utilizando una estrategia de PCR de 2 pasos, los productos de PCR IIC, IID, IIE, IIF e IIG, se sintetizaron en el primer paso, y los productos de PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF y IIIG, en el segundo paso para introducir mutaciones en todo el ADN CsgD. Los resultados de la EMSA de la unión HFQ a los ARN mutantes y de tipo silvestre CsgD transcritos in vitro, sintetizados con productos de PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF y IIIG, mostraron el aumento de los valores de KD de los alelos mutantes. Esto demostró que HFQ podría unirse menos eficientemente a los mutantes.
Además, HFQ tiene varios sitios de unión en CsgD, lo que se muestra en los tres turnos observados para el ARN de tipo salvaje. Sin embargo, sólo se observan dos sitios de enlace para diferentes ARN mutantes. Por lo tanto, el enfoque mutacional dirigido por el sitio identifica las estructuras primarias o secundarias del ARNm CsgD que son importantes para la unión completa de HFQ.
El método de mutagénesis dirigida por el sitio descrito aquí se basa en la PCR. Las buenas prácticas de PCR son cruciales para el método y podrían requerir la optimización para tener éxito. La mutagénesis dirigida por el sitio sólo es poderosa con los tres métodos como EMSA e Western Blotting.
Otros métodos, por ejemplo, incluyen varios ensayos estructurales y algunos ensayos de actividad, y estudios de modificación posterior a la traducción.
