このプロトコルは、動的平衡状態にあるナノスケールの生物学的システムの設計におけるさらなる調査への扉を開くため、重要である。この技術は、私たちが呼ぶことができるもの、自己治癒」または分子成分の動的置換を可能にするので、設計された構造と自然な構造の間のギャップの一部を埋めます。この手法を初めて試す際の最も重要なアドバイスは、実験者がすべての安全プロトコルに従っていることを確認することです。
まず、テキストプロトコルで概説されているように、ストックソリューションを準備します。小さいマイクロ遠心分離管にBRB80緩衝液のピペット21.8マイクロリットル。塩化マグネシウムストック溶液1マイクロリットル、GTPストック溶液1マイクロリットル、DMSOストック溶液1.2マイクロリットルを加え、微小管成長バッファーの調製を完了します。
微小管重合を開始するには、6.25マイクロチューブ成長バッファーを凍結乾燥チューブリンの20マイクログラムアリコートに直接加え、647ナノメートルで励起されるように標識します。40 RPSで5秒間渦を起用。氷の上のアリコートを5分間冷やします。
その後、摂氏37度で45分間インキュベートする。微小管安定化を開始するには、490マイクロリットルのBRB80バッファーに、アリクォートパクリタキセル溶液5マイクロリットルを加えます。30 RPSで10秒間、溶液をボルテックスします。
マイクロチューブのインキュベーションの45分がアップしたら、その溶液の5マイクロリットルをBRB80に加え、パクリタキセル混合物を加えてMT100溶液を作成します。まず、291マイクロリットルのBRB80バッファーに9.0マイクロリットルのジクォートカゼイン溶液を加えます。新しい6ミリリットルマイクロ遠心分離管にBRB80カゼイン溶液のピペット83マイクロリットル。
D-グルコース、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、DTT、クレアチンリン酸、ホスホキナーゼを1マイクロリットル加えます。次に、1マイクロリットルのストックATP溶液を運動性溶液に加える。フリック、または均質に化学物質を分配するアリコートを渦。
次に、1マイクロリットルの調製キネシン溶液を運動性溶液に加え、最終的な濃度が20ナノモルとなる。運動性溶液にMT100溶液の10マイクロリットルを加えます。フローセルの場合は、大きなカバースリップと小さなカバースリップの両方を使用します。
すべてのカバーリップをエタノールで2回、超純水で2回リンスします。洗ったカバーリップを超純水で5分間超音波処理します。その後、50〜75°Cの温度でオーブンでカバーリップを乾燥させます。
UV-オゾンクリーナーを使用して、各カバースリップの片側を室温および通常の大気条件で15分間処理します。ピンセットを使用して、各カバースリップを反転し、同様に未処理の側面を治療するためにUVオゾンを使用しています。処理されたカバーリップを超純水で5分間超音波処理します。
その後、50〜75°Cの温度でオーブンで乾燥させます。次に、テキストプロトコルで概説されているように保護具を着用します。各カバースリップを生理液に15秒間浸します。
カバーリップをトルエンで2回、メタノールで3回洗います。加圧窒素を使用してカバーリップを乾燥させます。カバースリップが乾燥したら、2センチメートルの両面テープを2.5センチメートル切ります。
この部分を2つの1センチメートルに2.5センチメートルのストリップに垂直に半分にカットします。繊細なタスクワイパーに大きなカバースリップを置き、テープストリップをエッジに沿って長さ方向に貼り付け、テープの破片の間に1センチメートルx 2.5センチメートルの領域を作成します。テープストリップの上に小さなカバースリップを貼り付けて、フローセルアセンブリを完成させます。
まず、約20マイクロリットルのPEG-PPG-PEG溶液を組み立てられたフローセルに流します。溶液を表面に5分間吸収させ、その後、この溶液を20マイクロリットルのBRB80バッファーと交換し、バッファーを3回流した。20マイクロリットルの運動性溶液をフローセルに流す。
この後、計画実験が1時間以上の場合に蒸発を防ぐために、フローセルの端をグリースで密封します。客観的型全内部蛍光顕微鏡を用いてイメージングを行う。目的に浸漬油の滴を置きます。
次に、フローセルを顕微鏡プラットフォームに置きます。目的とフローセル上の油との接触が起きるまで目的を持ち上げます。顕微鏡のインターロックカバーシステムを使用して、すべてのレーザー光を逃がすのをブロックします。
次に、レーザーをオンにし、マイクロチューブを画像化するために642ナノメートルレーザーを使用してフローセルの下面に焦点を当て、GFPキネシンモーターを画像化するために488ナノメートルレーザーを使用します。関心のある画像や動画を記録します。フローセルに運動性がある限り画像を記録できます。
本研究では、独自のトラックを構築するために弱く結合するビルディングブロックを自己組み立てるアクティブナノスケールシステムが提示される。tirf顕微鏡を使用して、滑空微小管はキネシンモーターから別々に画像化されます。微小管は647ナノメートルのレーザーと励起時に見える。
そして、GFPキネシンは488ナノメートルのレーザーで励起されると目に見える。励起と赤と緑の光の間の時間は1秒未満でした。見られるように、滑空微小管は溶液からキネシンモーターを蓄積し、表面に堆積させる。
キネシンモーターは、溶液に戻る前に、マイクロチューブの後に短時間残ります。運動性溶液の抗フェード中に試薬の正しい濃度を有することは非常に重要であり、そうでなければ、光の漂白は実験が失敗する原因となる。この技術は、ナノスケールのエンジニアシステムにおけるプロテインモータのより効率的な使用への道を開きます。
このように、より複雑なナノ構造の設計と研究が可能となる。
