이 프로토콜은 동적 평형에있는 나노 스케일 생물학적 시스템의 설계에 대한 추가 조사의 문을 열기 때문에 중요합니다. 이 기술은 우리가 부를 수 있는 무슨의 연구, 자기 치유'또는 분자 분대의 동적 교체를 가능하게 하기 때문에 설계되고 자연적인 구조물 사이 간격의 일부를 채웁니다. 이 기술을 처음으로 시도하는 가장 중요한 조언은 실험자가 모든 안전 프로토콜을 따르는지 확인하는 것입니다.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스톡 솔루션을 준비합니다. BRB80 버퍼의 파이펫 21.8 마이크로리터는 작은 미세 원심분리기 튜브로 들어갑니다. 염화 마그네슘 스톡 솔루션 1마이크로리터, GTP 스톡 용액의 마이크로리터 1개, DMSO 스톡 솔루션 1.2마이크로리터를 추가하여 마이크로튜버 성장 버퍼 를 준비합니다.
마이크로투블러 중합을 시작하려면 6.25 마이크로튜블러 성장 버퍼를 lyophilized tubulin의 20 마이크로그램 알리쿼트에 직접 추가하십시오. 5 초 동안 40 RPS에서 소용돌이. 얼음에 알리쿼트를 5분간 식힙니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 마이크로튜버 안정화를 시작하려면 BRB80 버퍼의 490 마이크로리터에 알리인용 파클리탁셀 용액 5마이크로리터를 추가합니다. 10초 동안 30 RPS로 용액을 소용돌이시다.
마이크로투블러에 대한 45분 의 인큐베이션이 완료되면 BRB80 및 파클리탁셀 혼합물에 5마이크로리터를 추가하여 MT100 용액을 만듭니다. 먼저, BRB80 버퍼의 291 마이크로리터에 알리인용 카제인 용액의 9.0 마이크로리터를 추가한다. 새로운 6 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 BRB80 카제인 용액의 Pipette 83 마이크로리터.
D-포도당, 포도당 산화제, 카탈라제, DTT, 크레아틴 인산염 및 인포키나아제 1 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음, 운동성 용액에 재고 ATP 용액의 마이크로리터 1을 추가합니다. 플릭, 또는 균질적으로 화학 물질을 배포하기 위해 알리쿼트 소용돌이.
다음으로, 최종 농도가 20 나노몰러인 운동성 용액에 준비된 키네신 용액 1마이크로리터를 첨가한다. MOTILity 솔루션에 MT100 솔루션의 마이크로리터 10개추가합니다. 유동 셀의 경우 큰 커버슬립과 작은 커버슬립을 모두 사용하십시오.
에탄올로 두 번, 초순수물로 두 번 커버립을 헹구는 다. 세척된 커버립을 초순수 물로 5분간 초음파 처리합니다. 그런 다음 섭씨 50도에서 75도 사이의 온도에서 오븐에서 커버립을 건조시십시오.
UV 오존 클리너를 사용하여 실온및 정상적인 대기 조건에서 각 커버슬립의 한쪽을 15분 동안 치료하십시오. 핀셋을 사용하여 각 커버슬립을 뒤집고 UV 오존을 사용하여 처리되지 않은 측면을 치료합니다. 처리된 커버립을 초순수물로 5분간 초음파 처리합니다.
그런 다음 섭씨 50도에서 75도 사이의 온도에서 오븐에서 건조하십시오. 다음으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 보호 장비를 착용하십시오. 각 커버슬립을 식염수 용액에 15초 동안 담급다.
커버립을 톨루엔으로 두 번, 메탄올에 세 번 씻으시다. 가압 질소를 사용하여 커버립을 건조시다. 커버립이 건조하면 2센티미터의 양면 테이프를 2.5cm로 자른다.
이 조각을 수직으로 반으로 2.5센티미터 스트립으로 2센티미터로 잘라냅니다. 큰 커버슬립을 섬세한 작업 와이퍼에 넣고 테이프 스트립을 가장자리에 따라 길이 방향으로 붙이면 테이프 조각 사이에 1센티미터 에서 2.5센티미터 면적을 만듭니다. 테이프 스트립 위에 작은 커버슬립을 붙이면 유동 셀 어셈블리를 완료합니다.
첫째, PEG-PPG-PEG 용액의 약 20마이크로리터를 조립된 유량 셀로 플로우한다. 용액이 5분 동안 표면에서 흡수한 다음 이 솔루션을 BRB80 버퍼 20마이크로리터로 버퍼를 3회 흐르게 한다. 운동성 용액의 20 마이크로리터를 유량 셀로 플로우합니다.
그 후, 계획된 실험이 1시간 이상 인 경우 증발을 방지하기 위해 유동 셀의 가장자리를 그리스로 밀봉한다. 객관적인 유형총 내부 꽃집 현미경 검사를 사용하여 이미징을 수행합니다. 목표에 침수 오일 한 방울을 놓습니다.
다음으로, 현미경 플랫폼에 유동 셀을 놓습니다. 그리고 목표와 유량 전지의 오일 접촉이 있을 때까지 목표를 달성하십시오. 현미경의 연동 커버 시스템을 사용하여 모든 레이저 빛이 탈출하는 것을 차단합니다.
이어서, 레이저를 켜고 642나노미터 레이저를 사용하여 유동셀의 하부 표면에 초점을 맞추어 마이크로투블러를 이미지화하고, 488 나노미터 레이저를 사용하여 GFP 키네신 모터를 이미지화한다. 관심 있는 이미지 나 동영상을 기록합니다. 이미지는 유동 셀에 운동성이 있는 한 기록될 수 있습니다.
이 연구에서는 자체 트랙을 구성하기 위해 약하게 결합하는 빌딩 블록을 자체 조립하는 활성 나노 스케일 시스템이 제시됩니다. 티프 현미경 검사를 사용하여 글라이딩 마이크로투볼은 키네신 모터와 별도로 이미지화됩니다. 마이크로튜브는 647 나노미터 레이저로 여기를 볼 수 있습니다.
그리고 GFP 키네신은 488 나노미터 레이저로 흥분할 때 볼 수 있습니다. 여기와 빨간색과 녹색 빛의 시간은 1 초 미만이었다. 볼 수 있듯이, 글라이딩 마이크로투볼은 용액에서 키네신 모터를 축적하고 표면에 보관합니다.
키네신 모터는 솔루션으로 돌아가기 전에 짧은 시간 동안 마이크로튜브의 여파로 남아 있습니다. 운동성 용액의 항페이드에서 시약의 정확한 농도를 갖는 것이 매우 중요하며, 그렇지 않으면 사진 표백으로 인해 실험이 실패할 수 있습니다. 이 기술은 나노 스케일 엔지니어 시스템에서 단백질 모터를 보다 효율적으로 사용할 수 있는 길을 열어줍니다.
따라서, 보다 복잡한 나노 구조의 설계 및 연구를 가능하게 한다.
