サッカロミセス・セレビシエ・キネシン-5 Cin8は双方向モータータンパク質である。Cin8は、単一の分子として微小管のマイナス端方向に移動し、多くの異なる実験条件下で方向性を変化させる。私たちの研究の全体的な目標は、Cin8の双方向運動性を調節する要因と構造要素を研究することによって、双方向運動性のメカニズムを理解することです。
このプロトコルは、酵母細胞で過剰発現されたGFP型完全長Cin8の精製、単一分子運動性アッセイ、およびCin8の単一分子およびクラスターの運動特性のその後の分析を包括的に説明しています。Cin8の方向性は微小管上のクラスターへの蓄積によって影響を受けるため、この分離は重要です。この技術は、酵母から他の核タンパク質を精製するために容易に適合させることができる。
さらに、蛍光強度に基づいてサイズグループに分離する必要がある任意の蛍光粒子に適用することができます。この手順を実証するのは、メアリー・ポポフ博士、私たちの研究室長、アリナ・ゴールドスタイン・レヴィティン博士、およびポスドク研究員のヌリット・シーグラー博士です。大学院生のタチアナ・ズヴァゲルスキー、マヤ・サダン、シラ・ハーシュフィンケル、当研究室の学部生ネタ・ヤニール、ヤヘル・アブラハム、ロイ・アブラハム、メイタル・ハーバーマン。開始するには、Cin8-GFP-6Hisの過剰発現のためのプラスミドを含むサッカロミセス・セレビシエ細胞を、摂氏28度で2%ラフィノースを添加した1リットルの酵母選択培地中で指数関数的増殖期に増殖させる。
次いで、2%ガラクトースを添加してCin8−GFP-6His過剰発現を誘導し、600ナノメートルでの吸光度を測定することによって酵母培養増殖をモニターした。ガラクトース添加の5時間後、遠心分離により菌体を回収する。細胞を溶解バッファーに再懸濁し、液体窒素で凍結する。
次に、チルド乳鉢及び乳棒を用いて、凍結菌体を液体窒素中で粉砕する。粉砕中に液体窒素を加え続け、抽出物が凍結したままになるようにする。位相または微分干渉コントラスト顕微鏡下で細胞溶解を監視します。
その後、粉砕した細胞を解凍し、遠心分離機で遠心分離する。上清を2ミリリットルのニッケル-NTAで満たされた重力流カラムにロードし、溶解バッファーで事前に平衡化します。上清をカラムから流出させます。
5 カラム容量の溶解バッファーでカラムを洗浄し、続いて 5 カラム容量の溶解バッファーに 25 ミリモルのイミダゾールを加えます。次いで、Cin8-GFP-6Hisを溶出緩衝液で溶出する。溶出したサンプルをSDS−PAGE分画によって分析し、続いてクマシーブルー染色およびウェスタンブロット分析を抗GFP抗体でプローブした。
Cin8-GFP-6Hisを含む画分をプールした後、毎分0.5ミリリットルの流速で、および1.5メガパスカルのカラム圧力限界でサイズ排除クロマトグラフィーによってそれらを精製する。同時に280ナノメートルでの吸光度を監視する。Cin8-GFP四量体に相当する画分を採取し、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより分析する。
次に、選択した画分をアリコートし、スナップフリーズし、マイナス80°Cで使用するまで保存します。ビオチンおよびローダミン標識微小管を重合および安定化させるには、反応成分を1.5ミリリットルのチューブで混合し、混合物を摂氏37度で1時間インキュベートする。その後、80マイクロリットルの温かい一般チューブリン緩衝液を加え、慎重に混合し、遠心分離機で遠心分離する。
上清を捨て、50マイクロリットルの温かい一般チューブリン緩衝液で上下にピしてペレットを注意深く再懸濁した。その後、サスペンションを摂氏28度または37度で保管します。647ナノメートルのローダミンチャネルを使用して、蛍光顕微鏡で微小管を調べます。
次に、テープストリップから保護紙を取り出し、ストリップ上にシラン処理されたカバースリップを配置して、3つの10マイクロリットルの体積流量チャンバを作成します。次いで、示された試薬を順次添加することによってカバースリップのアビジンコーティングを行う。カバースリップを3〜5分間インキュベートしてから、80マイクロリットルの一般的なチューブリン緩衝液で洗浄する。
次に、20マイクロリットルの微小管をフローチャンバに挿入することによって、ビオチン化微小管をb-BSA/アビジンコーティングカバースリップに取り付けます。スライドを、カバースリップを下向きにして、暗湿度チャンバー内で室温で5分間インキュベートする。その後、スライドを200マイクロリットルの一般的なチューブリンバッファーで洗浄します。
次に、30マイクロリットルの運動性反応混合物に続いて、20マイクロリットルの運動性反応混合物で希釈したCin8-GFPモーターをフローチャンバに塗布し、直ちに微小管に沿ったモーターの動きを画像化する。運動性イメージングでは、顕微鏡の対物レンズに液浸オイルを一滴置き、フローチャンバーを蛍光顕微鏡ステージに置き、カバースリップを対物レンズに向けます。ローダミンチャネルをオンにして、カバースリップ表面に取り付けられた微小管に焦点を合わせます。
次に、ImageJマイクロマネージャーソフトウェアを使用して、20ミリ秒の露光で画像を取得します。次に、GFPチャンネルをオンにして、1秒間隔と800ミリ秒の露出で90枚のタイムラプス画像を取得します。ImageJ フィジー ソフトウェアで、タイムラプス ムービーと対応する微小管フィールド画像を開きます。
これら 2 つのウィンドウを同期するには、[分析] を選択し、[ツール] と [ウィンドウの同期] を選択します。キモグラフを取得するには、[セグメント化された線] オプションを使用して 1 つの微小管を強調表示します。次に、[分析] から [マルチキモグラフ] タブを選択します。
Cin8-GFP分子のクラスターサイズを決定するには、プロセスをクリックして背景の減算と不均一な照明の補正を実行し、続いて背景の減算を行います。[ローリングボールの半径] を 100 ピクセルに設定し、[放物面をスライドさせる] オプションをオンにします。次に、ImageJフィジーソフトウェアのTrackMateプラグインを使用して、特定の非運動性Cin8-GFPモーターを追跡します。
プラグインを選択し、その後にトラッキング、トラックメイト、LoG検出器、およびシンプルLAPトラッカーを選択して、Cin8-GFPモーターの平均蛍光強度を半径4ピクセルの円内の時間の関数として追跡します。異なるCin8-GFPモーターについてこの手順を繰り返した後、蛍光強度を時間の関数としてプロットします。次に、微小管トラックに沿ってCin8-GFP分子の運動性を追跡するために、長方形ツールで強調表示して画像をクリックし、続いて[切り抜き]をクリックして、記録されたフレームのタイムラプスシーケンスで分析する微小管をトリミングします。
分析のために蛍光Cin8-GFP粒子を選択してください。タイムラプスシーケンスの各フレームのパーティクル座標を、ポイントツールと「測定」(Measure) オプションを使用して記録します。同様に、他の蛍光粒子の座標をタイムラプス配列に記録する。
次に、前述のように、外観の最初のフレームで検査されたすべてのCin8-GFP粒子にクラスターサイズを割り当てます。次に、指示された式と決定されたCin8-GFP移動座標とを用いて、初期座標に対する各時点におけるCin8-GFPの変位を算出する。これらの変位値から、指定された Cin8-GFP 粒子について可能なすべての時間間隔の変位を計算します。
検査したすべてのCin8-GFP粒子についてこの手順を繰り返します。最後に、調べたすべてのCin8-GFP粒子の平均変位を時間間隔に対してプロットし、線形適合に供します。この適合の傾きは、運動性Cin8-GFP粒子の平均速度を表す。
単一の微小管上の異なるクラスターサイズの双方向モータータンパク質Cin8の運動性特性をここに示す。クラスターサイズカテゴリごとに、個々のCin8-GFPの40以上の軌道が記録から抽出されました。単一分子およびCin8モーターのクラスターの平均変位を時間間隔の関数としてプロットすると、単一のCin8-GFP分子が一方向マイナス末端指向的に高速で移動することが実証された。
対照的に、Cin8クラスターは、より低い速度およびより高い双方向運動性を示す。この手順を実行している間、高純度のモータータンパク質を使用して、モータークラスタリングに影響を与える可能性のある汚染を回避する必要があります。モーターの蛍光強度を分析する際には、フォトブリーチングの影響を避けるために、表示される最初のフレームのモーターを調べることが重要です。
双方向モータの運動性を研究する際には、モータクラスタリングがモータの方向性に影響を与える重要な要素の1つであるため、単一分子とクラスタを別々に解析することが非常に重要です。
