Este protocolo é significativo porque abre as portas para uma investigação mais aprofundada no projeto de sistemas biológicos nanoescala que estão em equilíbrio dinâmico. Essa técnica preenche parte da lacuna entre estruturas projetadas e naturais porque permite o estudo do que poderíamos chamar, a auto-cura ou a substituição dinâmica de componentes moleculares. O conselho mais importante para tentar essa técnica pela primeira vez é garantir que o experimentador esteja seguindo todos os protocolos de segurança.
Primeiro, prepare as soluções de ações conforme descrito no protocolo de texto. Pipeta 21,8 microliters de BRB80 Buffer em um pequeno tubo de micro centrífuga. Adicione 1 microliter da solução de estoque de cloreto de magnésio, 1 microliter da solução de estoque GTP e 1,2 microliters da solução de estoque DMSO para terminar de preparar o buffer de crescimento de microtúbulos.
Para iniciar a polimerização de microtúbulos, adicione 6,25 microliters de tampão de crescimento de microtúbulos diretamente em uma alíquota de 20 microgramas de tubulina liofilizada;rotulada para ser animada em 647 nanômetros. Vórtice a 40 RPS por 5 segundos. Esfrie a alíquota no gelo por 5 minutos.
Em seguida, incubar a 37 graus Celsius por 45 minutos. Para iniciar a estabilização dos microtúbulos, adicione 5 microliters da solução paclitaxel aliquoted a 490 microliters de buffer BRB80. Vórtice a solução a 30 RPS por 10 segundos.
Uma vez que os 45 minutos de incubação para os microtúbulos se elevem, adicione 5 microliters dessa solução ao BRB80, e mistura de paclitaxel, para criar a solução MT100. Primeiro, adicione 9,0 microliters da solução de caseína aliquoted a 291 microliters de buffer BRB80. Pipette 83 microliters da solução de caseína BRB80 em um novo tubo de micro centrífuga de 6 mililitros.
Adicione 1 microliter de D-glicose, glicose oxidase, catalase, DTT, fosfato de creatina e fosfokinase. Em seguida, adicione 1 microliter da solução ATP de estoque à solução de motilidade. Filme, ou vórtice a alíquota para distribuir homogêneamente os produtos químicos.
Em seguida, adicione 1 microliter de solução de cinesina preparada à solução de motilidade, de tal forma que a concentração final seja de 20 nanomolar. Adicione 10 microliters da solução MT100 à solução de motilidade. Para células de fluxo, use uma tampa grande e uma pequena mancha de cobertura.
Enxágüe todas as tampas duas vezes com etanol e duas vezes com água ultrauso. Sonicar as tampas lavadas em água ultrauso por 5 minutos. Em seguida, seque as tampas em um forno a uma temperatura entre 50 e 75 graus Celsius.
Use um limpador de UV-ozônio para tratar um lado de cada tampa por 15 minutos em temperatura ambiente e em condições atmosféricas normais. Usando pinças, gire cada tampa e use UV-ozone para tratar o lado não tratado também. Sonicar as tampas tratadas em água ultrauso por 5 minutos.
Em seguida, seque-os em um forno a uma temperatura entre 50 e 75 graus Celsius. Em seguida, don equipamento de proteção como descrito no protocolo de texto. Mergulhe cada tampa em solução salina por 15 segundos.
Lave as tampas duas vezes em tolueno e três vezes em metanol. Use nitrogênio pressurizado para secar as tampas. Uma vez que as tampas estejam secas, corte um pedaço de fita dupla face que é de 2 centímetros por 2,5 centímetros.
Corte esta peça ao meio verticalmente em duas tiras de 1 centímetro por 2,5 centímetros. Coloque a grande mancha de cobertura em um delicado limpador de tarefas e coloque as tiras de fita nele, em termos de comprimento ao longo das bordas para criar uma área de 1 centímetro por 2,5 centímetros entre as peças de fita. Coloque a pequena mancha de cobertura em cima das tiras de fita para terminar o conjunto da célula de fluxo.
Primeiro, flua aproximadamente 20 microliters da solução PEG-PPG-PEG para a célula de fluxo montada. Deixe a solução absorver na superfície por 5 minutos, então, troque esta solução com 20 microliters de buffer BRB80 três vezes, fluindo o buffer. Flua 20 microliters da solução de motilidade para a célula de fluxo.
Depois disso, sele as bordas da célula de fluxo com graxa para evitar a evaporação se o experimento planejado for superior a uma hora. Realize a imagem utilizando uma microscopia de florescónce interna do tipo objetivo. Coloque uma gota de óleo de imersão no objetivo.
Em seguida, coloque a célula de fluxo na plataforma do microscópio. E trazer o objetivo até que haja contato entre o óleo no objetivo e a célula de fluxo. Use o sistema de cobertura de bloqueio do microscópio para impedir que toda a luz laser escape.
Em seguida, ligue o laser e foque na superfície inferior da célula de fluxo usando um laser de 642 nanômetros para a imagem dos microtúbulos, e um laser de 488 nanômetros para a imagem dos motores gfp cinésin. Grave as imagens ou vídeos de interesse. As imagens podem ser gravadas enquanto houver motilidade na célula de fluxo.
Neste estudo, é apresentado um sistema ativo de nanoescala, que se auto-monta blocos de construção fracamente vinculando para construir sua própria pista. Usando microscopia de tirf, microtúbulos deslizantes são imagem separadamente dos motores de cinesina. Microtúbulos são visíveis após excitação com um laser de 647 nanômetros.
E a cinesina GFP é visível quando excitada com um laser de 488 nanômetros. O tempo entre excitação e a luz vermelha e verde foi inferior a um segundo. Como se pode ver, microtúbulos deslizantes acumulam motores de cinesina da solução e os depositam na superfície.
Os motores de cinesina permanecem na esteira dos microtúbulos por um curto período de tempo antes de retornar à solução. É muito importante ter a concentração correta de reagentes no antifade da solução de motilidade, caso contrário, o branqueamento fotográfico faria com que o experimento falhasse. Esta técnica abre caminho para um uso mais eficiente de motores proteicos em sistemas de engenharia nanoescala.
Assim, possibilitando o desenho e o estudo de nanoestruturas mais complexas.
