Name: identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
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Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

tdTomatoタグ付き野生型とモータレスKIF5Bタンパク質の1クローニング<ol><li> 表1のプライマーを用いてヒト野生型とモータレスKIF5Bタンパク質のためのcDNAを増幅し、Taq DNAポリメラーゼ（100μlの5単位）、dNTPミックス（各デオキシヌクレオチド2ミリモル）および30サイクルの10×緩衝液。各サイクルは、変性工程（30秒間、95℃）、アニーリングステップ（30秒45°C）と伸長工程（3分間72°C）からなります。 </li><li>等量のフェノール/クロロホルムを用いて増幅されたDNA産物を抽出し（1：1）。 注：フェノールは可燃性で火傷を引き起こす可能性があります。クロロホルムは危険です。彼らとの直接接触を避け、化学ヒュームフードの下でそれらを使用しています。あるいは、PCR産物は、種々のキットによって精製することができます。 <ol><li> 1分間室温で微量で18,000×gでスピン。新しいチューブに水溶液に移し、等量のクロロホルムで抽出します。 </li><li>スピン0.5分間、室温で微量で18,000×gで。新しいチューブに水溶液を移します。 </li><li> 3 M酢酸Na、無水エタノールの2容積の10分の1の体積の水溶液を混ぜます。 </li><li>室温で5分間微量で18,000×gでスピン。水溶液を捨てます。 </li><li> 75％エタノールの2つのボリュームでDNAペレットを洗浄します。 5分間室温でDNAペレットを乾燥させた水溶液と空気を捨てます。 34μlの水でDNAペレットを再懸濁します。 </li></ol></li><li>制限酵素SalIを（10単位）とBamHI（10単位）と2時間37℃でその10×緩衝液4μlの40μlの最終容量で増幅産物を消化します。臭化エチジウム（0.2μgの/ ml）を含むアガロースゲル（100 Vで1.0％）で消化された製品を解決します。 注：エチジウムブロマイドは、強力な突然変異誘発物質であり、皮膚を介して吸収することができます。したがって、W直接的または間接的な接触を避けることが重要ですi番目の臭化エチジウム。 </li><li>カラムによる精製のための正しいバンドを切り出します。 DNA断片を含むアガロースゲルを秤量します。その後、約20分間37℃で可溶化緩衝液（0.1グラム、300μL）でそれを溶解します。 </li><li> 5秒間、室温で微量の列とスピンに得られた溶液を追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>ステップ1.5を繰り返して、0.5ミリリットルの可溶化緩衝液でカラムを洗浄します。ステップ1.5を繰り返して、0.75ミリリットル洗浄緩衝液で再びカラムを洗浄。残りの洗浄緩衝液を取り除くために2分間の列をスピン。 </li><li>ステップ1.5を繰り返して、50μlの水を有するDNA断片を溶出します。臭化エチジウム（0.2μgの/ ml）を含むアガロースゲル（100 Vで1.0％）でDNAサイズラダーに対してそれのアリコートを実行して、DNA断片の濃度を推定します。 </li><li>以前番目で消化ptdTomato-C1ベクター17（約100 ngの）で精製品（約100 ngのを）連結E同じ制限を16時間室温でT4 DNAリガーゼ（2,000単位）および1μlの10×ライゲーション緩衝液を用いて、10μlの酵素。 注：野生型およびモータレス変異体は、それぞれ、2 963から963と584のアミノ酸が含まれています。以前は、より大きなモータレスKIF5B変異体は、その機能9を同定するために使用しました。より小さいモータレスKIF5B変異体は、その発現レベルを増加させるために、本研究に使用しました。 </li></ol> 2.免疫蛍光顕微鏡<ol><li>生細胞または、又は40X以下の倍率との間接蛍光イメージング、1mlの完全培地中に0.2〜0.3百万HeLa細胞を播種の各ウェルの[ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清（DMEM）（FBS）] 6ウェルプレート。 5％CO 2で37℃で成長します。 </li><li>空気乾燥それらの中に、短時間無水エタノールに、40倍以上の倍率との間接免疫蛍光研究のために、（1.5厚さのx 18ミリメートル18ミリメートル）カバーガラスを洗います安全キャビネット内部の6ウェルプレートのウェルは、汚染を回避します。 <ol><li> 1種0.2〜0.3百万個の細胞を6ウェルプレートの各ウェルにDMEM培地を完了mLです。 </li></ol></li><li>トランスフェクション複合体の調製<ol><li>次の日は、バイオセーフティキャビネット内、貨物候補タンパク質のための発現プラスミドの存在下または非存在下でtdTomatoタグ付き野生型またはモータレスKIF5Bのための発現プラスミドの0.6μgの（合計）希薄（pTagCFP-C-MYC 5 ）1.6ミリリットルマイクロ遠心チューブで0.1ミリリットルトランスフェクション培地と。 注：ベクトルpTagCFP-C-MYCはTagCFPタグ付きのc-MYCを発現します。 </li><li>別の1.6ミリリットルのマイクロチューブに0.1ミリリットルトランスフェクション培地にトランスフェクション試薬の1.8μlを添加します。一般的に、12個のサンプルのための十分な希釈トランスフェクション試薬のマスターミックスを調製します。 </li><li>室温で、5分間インキュベートします。 </li><li>希釈した0.1ミリリットルのDNAに希釈した0.1ミリリットルトランスフェクション試薬を追加します。ミチューブを反転させて内容をxは。微量で5秒間チューブをスピン。 </li><li>室温で、45分間インキュベートします。 </li></ol></li><li>細胞の洗浄<ol><li>トランスフェクション複合体の形成のためのインキュベーション期間中に播種した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。 </li><li>各ウェル0.8ミリリットルと予め温めたトランスフェクション培地中で播種した細胞の培地を交換してください。 37℃のインキュベーターにプレートを返します。 </li></ol></li><li>細胞のトランスフェクション<ol><li> 45分のインキュベーションの後、（ステップ2.3で調製した）DNA /トランスフェクション試薬複合体0.2 mlを加え、プレートの各ウェルに滴下しました。 </li><li>彼らは、37℃のインキュベーターに戻される前に、5秒間穏やかに6ウェルプレートを揺らし。 </li><li> 6-8時間後、完全DMEM培地で培地を交換してください。 </li></ol></li><li>ライブセル蛍光イメージング18 <ol><li>インキュベーションaの追加の16時間後トン37°Cは、1μMの最終濃度になるように培地にDNA挿入染色ヘキスト33342を追加します。 注：ヘキスト33342は、細胞核を染色する細胞透過性、DNAインターカレート色素です。 </li><li> 40倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡によって蛍光タンパク質の発現のためにそれらを検査する前に、37℃のインキュベーター中で10分間トランスフェクトされた細胞を培養します。 DAPI、CFP、FITCおよびCy3用のフィルターセットはそれぞれ、（Ex350 nmの/ Em460のnm）を、（Ex436 nmの/ Em480のnm）を、（Ex470 nmの/ Em525のnm）を（Ex545 nmの/ Em605のnm）です。 注：バックグラウンドが原因で完全DMEM培地の自己蛍光に高い場合、フェノールレッドを含まない培地を使用しています。 </li></ol></li></ol>間接免疫学3. <ol><li>パラホルムアルデヒド溶液の調製<ol><li>パラホルムアルデヒド粉末（100ミリリットルPBSあたり4グラム）を計量し、PBSに追加します。 注：パラホルムアルデヒドは、可燃性固体と潜在的な癌ハザルですD。それは、目、呼吸器系および皮膚を刺激します。したがって、との接触またはパラホルムアルデヒドの吸入を避けることが重要です。 </li><li>溶液（150μlの10 NのNaOH / 100ミリリットル）に水酸化ナトリウムを追加します。 </li><li>時折振とうしながら2〜3時間、37〜42℃で溶液を保管してください。 </li><li>パラホルムアルデヒド粉末を溶解させた後に溶液（約75マイクロリットル/ 100ミリリットル）に氷酢酸を加えることによって、pHを7.0に調整します。 </li></ol></li><li>ターゲットタンパク質染色<ol><li> 37℃で16時間さらにインキュベートした後、5秒間6ウェルプレートを旋回することによりPBSで一度室温でトランスフェクトされた細胞を洗浄します。 </li><li>ウェルあたり新たに調製し、4％パラホルムアルデヒド溶液1mlで細胞を固定してください。室温で30分間インキュベートします。 </li><li> 5秒間6ウェルプレートを旋回させることにより、一度PBSで細胞を洗浄。ソリューションを捨てます。 </li><li> 30分間室温にて（PBS中）0.1％トリトンX-100の1mlで細胞をインキュベートします。 DETトリトンX-100は、それらの細胞内標的への抗体のアクセスを可能にするために、細胞膜を透過しますergent。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回細胞を洗浄。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li><li> 4時間揺動することにより、室温でPBS溶液中で、10％FBS中で、（0.1 / mlのC-MYCのウサギ抗体またはp53マウス抗体）一次抗体の1ミリリットルで細胞をインキュベートします。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回洗浄します。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li><li> 2時間揺動することによって暗所で室温でPBS中10％FBS中で、蛍光色素結合二次抗体（0.5 / mlのアレクサフルオロ488結合抗ウサギまたは抗マウスIgG抗体）1mlでインキュベートします。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回洗浄します。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li></ol></li><li>核染色および取り付け<ol><l10分間、暗所で、室温でPBS中、（0.5 / mlのDAPI）i&gt;はDNA挿入色素4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを1mlで細胞をインキュベートします。何のカバーガラスが使用されていない場合3.4に進みます。 注：DAPIは細胞核を染色するDNAインターカレート色素です。 </li><li>各顕微鏡スライド上にマウント溶液10μlを適用します。顕微鏡スライド上にマウントソリューションの上に、各カバーガラスをマウントします。 </li><li>暗所で一晩中、室温でインキュベートします。 </li><li>マニキュアでカバーガラスの端をシールします。一晩マニキュア煙を除去するために、ヒュームフード内部の暗所に置きます。 </li></ol></li><li>蛍光顕微鏡19 <ol><li>翌日、40倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡によって細胞を調べます。 DAPI、CFP、FITCおよびCy3用のフィルターセットはそれぞれ、（Ex350 nmの/ Em460のnm）を、（Ex436 nmの/ Em480のnm）を、（Ex470 nmの/ Em525のnm）を（Ex545 nmの/ Em605のnm）です。 </li></ol></li></ol>

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記載の方法は、微小管に沿って移動する能力を欠くモータレスKIF5B変異体の特性を利用するが、野生型KIF5Bと二量体を形成し、それによって、四量体タンパク質は、同一の積荷タンパク質と相互作用することを可能にする能力を保持します野生型KIF5Bなど。モータレスKIF5Bは、したがって、その貨物に集約しmislocalizedドミナントネガティブ変異体やフォームとして機能します。この方法は、キネシン-1貨物のc-myc（ 図1）5 を識別するために実証されています。この記事では、同一のモータレスKIF5B変異体は、キネシン-1の別の潜在的なカーゴ（ 図2）としてのp53を同定しました。これは、方法は、キネシン-1の他の貨物を識別することが可能であることを示しています。さらに、変異体の特異性は、陰性対照タンパク質のc-Fosの（ 図3）上の変異の効果の欠如によって提供されます。 このプロトコルでは、tdTomatoタグ付き野生TYPEまたはモータレスKIF5Bタンパク質は、他の蛍光タンパク質タグ付き候補貨物のタンパク質と同時発現されます。この場合、生細胞の蛍光顕微鏡および画像化が行われます。凝集体の形成は、タイムラプスイメージングにより追跡することができます。あるいは、tdTomatoタグ付きタンパク質を単独で発現され、その生理学的なレベルで、候補貨物タンパク質は特異的抗体を用いた間接免疫蛍光顕微鏡法によって可視化されます。蛍光タンパク質tdTomatoは、その明るさと光安定17のために選択されます。背景は完全DMEM培地の自己蛍光に起因する高い場合、フェノールレッドを含まない培地を使用します。 モータレスKIF5B変異体は、化学量論的に野生型KIF5Bと二量体を形成します。したがって、その機能を阻害するために、野生型対応物との二量体を形成し、凝集体を形成するモータレスKIF5B変異体の十分な量を発現することが重要です。 、exprの最適化をこの問題に対処するために、モータレス変異体のessionが不可欠です。これは、二量体化ドメインを含む小さなモータレス変異体を使用することによって達成されます。さらに、適切なトランスフェクション試薬とプロトコルの最適化も必要です。 DNA /トランスフェクション試薬でHeLa細胞のインキュベーションの持続時間は、外因性タンパク質の発現および細胞生存率を、HeLa細胞中で最適化しました。インキュベーション期間は、他の細胞株のために最適化されなければなりません。 40Xへ4X間の倍率については、何のカバーガラスは必要ありません。細胞を直接ウェルに調べることができます。したがって、この場合には、プロトコルは、安価で便利です。 40X上記倍率のために、細胞を染色した後、油浸対物レンズ下の検査のために顕微鏡スライド上にマウントされ、ウェル中のカバーガラス上で増殖させています。 モータレスKIF5Bタンパク質の凝集の観察は、細胞質のサイズによって制限されます。検出が容易です多くの哺乳動物細胞中での集合体。しかし、細胞質の容積が核周囲および神経突起における小さい場合に神経細胞内凝集体を観察することは比較的困難です。 プロトコルは 、インビボ酵母ツーハイブリッドおよび生化学的プルダウンアッセイ13-16に加えKIF5Bと貨物との間の関連を示すために使用されます。すべてのこれらのアッセイは、異なる物理的条件下での関連性を決定し、それらの結果は、お互いを補完することができます。また、他のアッセイに対するこの蛍光アッセイの利点は、KIF5Bによって貨物の細胞内局在化（ 図1及び2）の調節を示すことができることです。 プロトコルは、KIF5Bに限定されるものではなく、そのような他のいくつかのキネシンモーター3と貨物3の細胞内輸送に使用されるミオシンモーター23,24の一部として、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。これらのモータータンパク質はまた、オリゴマー化のためのキネシンモーターとミオシンモーター用マイクロフィラメント、およびコイルドコイルセグメントのための微小管に沿って移動用モータドメインを含みます。それらのほとんどは、ホモ二量体3,23を形成します 。したがって、同様の戦略は、その貨物を識別するために、それらのモータレスドミナントネガティブ変異体を作成することによって、それらを適用することができます。

キネシン-1は、その貨物1,2の順行性輸送を媒介するモータータンパク質です。これは、キネシン軽鎖1（KLC1）とキネシン重鎖の2つのサブユニット（KHCs）の二つのサブユニットのヘテロ四量体です。 KIF5B 1、KHCは、そのN末端 ​​、ATPを加水分解し、微小管に沿った移動のための機械的エネルギーに化学エネルギーに変換するにモータードメインが含まれています。そのC末端領域は、貨物と関連付けるKLC1、と相互作用する二量体化ドメインが含まれています。キネシン-1は、小胞、細胞小器官およびmRNAを3,4として貨物を輸送します。最近、KIF5Bは細胞質5プロテオソーム分解の核転写因子のc-MYCを輸送することが示されました。三つの方法（化学的阻害剤は、siRNA / shRNAのドミナントネガティブ変異体）は、キネシン-1機能を阻害するために使用されました。彼らはすべての細胞質中でのc-MYCの凝集を誘導しました。最後の方法論では、c-MYCのみが支配的negatの影響を受けましたアイブKIF5Bの変異体ではなく、別の関連KIF5Aモータータンパク質のそれによって、変異体は、（微小管破壊など）の細胞内成分上またはタンパク質凝集の一般的な影響を及ぼさないことを示唆しています。 KIF5Bのドミナントネガティブ変異体はまた、転写因子の一般的な効果を発揮しないことを示唆している、他の転写因子に影響を及ぼしませんでした。むしろ、それは、ドミナントネガティブ変異体は、その貨物の特定の効果を発揮することを示唆しています。 ドミナントネガティブ変異体の使用は、モータータンパク質の分野では一般的です。キネシンとミオシンの類似モータレス変異体は、以前に使用されました。これらは主に貨物の細胞内局在にまたは6-12細胞機能の変異体の効果を実証するために使用されました。あまり重点が変異体およびそれらによって影響を受けた貨物の間の空間的関係に置かれました。しかし、いくつかの発生率では、変異体は、そのCAと共局在することが観察されましたrgos 6,10。 KIF5Bおよびその関連タンパク質との間の相互作用は、以前のインビボ酵母ツーハイブリッドアッセイなどの共免疫沈降およびインビトロプルダウンアッセイ13-16 における生化学的プルダウンアッセイにより確認されました。この記事では、蛍光顕微鏡を使用して追加の視覚的方法は、KIF5B貨物タンパク質を同定するために記載されています。この方法は、ドミナントネガティブ変異体として機能するモータレスKIF5B変異体を使用しています。これは、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。 17 tdTomato蛍光タンパク質と野生型およびモータレスKIF5B変異体のタグ付けは、蛍光顕微鏡によって、その可視化を可能にします。タグ付けされたKIF5Bタンパク質は、適切にKIF5Bタグから分離されたスペクトル特性を有する異なる蛍光タンパク質に融合された候補タンパク質と共発現させることができます。タグ付けされたタンパク質は、生きた細胞内で直接観察されます蛍光顕微鏡下で。モータレスKIF5B変異によって候補タンパク質の凝集の誘導は、候補タンパク質がKIF5B の in vivoでの貨物であることを確認します。また、tdTomatoタグKIF5Bタンパク質は、内因性の積荷タンパク質に対するそれらの効果を研究するために細胞内で単独で発現させることができます。その後、免疫蛍光顕微鏡は、蛍光色素と結合し、適切な二次抗体、続いて、トランスフェクトした細胞を固定し、内因性候補タンパク質に対して特異的な抗体で染色された中で行われます。この場合には、その生理的なレベルで内因性の候補タンパク質が検討されています。他のモータータンパク質の類似モータレス変異体は、その貨物を識別するために調製することができます。

<table><tbody><tr><td>absolute ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (transfection medium)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 mouse antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>computer software for imaging</td><td>&amp;nbsp;cellSens&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

外因的には、c-MYCは、核（図1A）に主に現れ、一方、野生型KIF5Bは、細胞質中に均一に見えた発現しました。しかし、モータレスKIF5B変異体は、細胞質（図1A）で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの集約は、c-MYCの凝集を誘導しました。野生型KIF5Bを発現する細胞内で凝集TagCFPタグのc-MYCを発現する細胞の割合は低かったです。しかし、モータレスKIF5Bが（図1A）を共発現させたときに有意に高かったです。 C-MYCと変異KIF5Bの観察された共局在（図1）は、KIF5Bをc-MYCの細胞内局在を調節およびc-MYCのキネシン-1の貨物であることを示唆しています。構築物は、単独で発現された負の対照は、図1Aの下のパネルに含まれています。結果は、蛍光emissioの有意なブリードスルーがなかったことを示しn個。モータレスKIF5Bはまた、内因性のc-MYC（図1B）および転写因子p53の（ 図2）の凝集を誘導したことを示します c-MYCおよびp53の両方キネシン1の貨物であり、KIF5Bは、両方の内因性タンパク質の細胞内局在を調節します。一緒にキネシン-1阻害剤は、C-MYCおよびp53 5の両方のために高分子量種のベンガルラクトン（RBL）20誘発形成を上昇した結果と、p53はおそらくキネシン1の貨物です。 c-MYCのような核内転 ​​写因子であるp53は、また、プロテアソーム分解21,22のための核から細胞質へ輸出されることに注意することは興味深いことです。 KIF5Bによる転写因子の動きがモータレスKIF5B変異体の発現は、細胞内局在のc-Fosのに影響を与えるか、それが（ 図3）を集約することはありませんでしたので、特異的であるように思われる。上記のデータは、メトことを実証しています本書に使用さdはキネシン1貨物の高特異性の同定を可能にします。同様の戦略は、他のモータータンパク質にも適用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> 図1：モータレスKIF5B変異体の発現は、細胞質におけるc-MYCの凝集を誘導する （A）HeLa細胞をtdTomatoタグ化野生型（WT）KIF5B（赤）及びTagCFPタグC-MYC（青）でトランスフェクトしました。 TagCFPタグ付きのc-MYCは核で主に登場しながらtdTomatoタグ付きWT KIF5Bは、細胞質に主に登場しました。しかし、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質中の糸状または点状凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、c-MYCの凝集を誘導しました。変異KIF5Bおよびc-MYCが一緒に共局在（ピンク）。 CFP-C-MYC（％）の凝集を示す細胞（％）の割合が示されています。結果は以下のように示されています平均±SD（N = 3）。 tdTomatoタグ付きKIF5Bタンパク質または空のベクター（V）と一緒にTagCFPタグ付きのc-MYCの発現を有するネガティブコントロールは、下のパネルに示されています。 （B）同様の結果がtdTomatoタグ付きWTまたはモータレスKIF5Bタンパク質（赤）を発現させた内因性のc-MYC（緑）で得られました。 tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体は、細胞質内で凝集体を形成し、内因性のc-MYCの凝集を誘導しました。細胞質（オレンジ色）で一緒に共局在凝集体の両方の種類。核染料ヘキスト33342、またはDAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> 図2：モータレスKIF5B変異体の発現は、トンで、内因性のp53の凝集を誘発します彼は、HeLa細胞では細胞質、外因性tdTomatoタグ付き野生型（WT）KIF5B（赤）、内因性のp53（緑）は、主に核内に登場している間、細胞質で主に登場。これとは対照的に、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質内で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、細胞質（黄色）でKIF5Bの共局在とp53で、その結果、p53の凝集を誘導しました。実験は3回行いました。核色素DAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> 図3：モータレスKIF5B変異体の発現は細胞質中でのc-Fosのの凝集を誘導しない tdTomatoタグ付き野生型（WT）KIF5B（赤）が登場しました主に、HeLa細胞の細胞質に、EGFP-C-Fosの（緑色）、一方、核に主に現れました。逆に、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質内で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、c-Fosのの凝集を誘導しませんでした。実験は4回行いました。細胞の核を染色DAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>共通のリバースプライマー</td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td>野生型KIF5Bフォワードプライマー</td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td>モータレスKIF5Bフォワードプライマー</td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>表1：野生型およびモータレスKIF5Bタンパク質をクローニングするためのプライマー配列。

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Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

ここでは、プロトコルは、キネシン-1貨物を識別するために提示されています。キネシン-1重鎖（KIF5B）のモータレス変異体は、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。両方の凝集体は、蛍光顕微鏡下で検出されます。同様の戦略は、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.9K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. ここでは、プロトコルは、キネシン-1貨物を識別するために提示されています。キネシン-1重鎖（KIF5B）のモータレス変異体は、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。両方の凝集体は、蛍光顕微鏡下で検出されます。同様の戦略は、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。 

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Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

化学

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

発生生物学

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

工学

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

生化学

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

神経科学

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

生物学

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

核輸送の1分子イメージング

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.