ここでは、抗真菌タンパク質を発現するトウモロコシカーネルにおけるアスペルギルス・フラヴスの成長とアフラトキシン産生を分析するための簡単なカーネルスクリーニングアッセイを提示する。アスペルギルスフラバス株を発現する緑色蛍光タンパク質を用いて、成熟したカーネルにおける真菌の感染と広がりをリアルタイムで監視します。この簡単なアッセイは、アスペルギルスフラヴス感染およびアフラトキシン産生に抵抗するトウモロコシカーネルの能力を評価する信頼性の高い手段を提供する。
成熟したカーネル上の制御された条件下で行われたこの実験室のアッセイからの結果は、フィールド条件下での感染の結果とよく相関する。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のポスドクであるRajtilak Majumdar博士と、クリスティーン・シックラーとデビッド・アンブロジオ(私たちの研究室の生物科学技術者)です。まず、ペトリ皿に20の2mmのスナップキャップを接着してKSAキャップを作成します。
接着剤を48時間乾燥させてからキャップを使用します。生物学的安全キャビネットでは、水に70%エタノールを用いた正方形のバイオアッセイトレイをスプレーします。トレイの空気を乾燥させます。
滅菌クロマトグラフィー用紙をドライトレイに追加します。KSAキャップの9個に70%エタノールをスプレーし、空気乾燥させます。その後、バイオアッセイトレイにキャップを置きます。
テストされているトランスジェニックトウモロコシラインごとに、20個の損傷していないカーネルを選択し、50ml遠心管に入れる。卓上のステレオ顕微鏡を使用して、アッセイのために損傷していないカーネルのみを選択します。損傷したカーネルはアスペルギルス攻撃の影響を受けやすく、より多くのアフラトキシンを産生し、それによって結果を歪め、その多様性の真の抗真菌または抗菌特性を表さない。
各チューブに70%エタノールを加えます。カーネルを4分間殺菌させ、時折穏やかに揺らします。この後、エタノールを穏やかに注ぎ、滅菌脱イオン水でカーネルを3回静かにすすいだ。
V8培地上で増殖したGFPを発現するアスペルギルスフラブラスステイン70の6日間培養液を得る。20mlの無菌0.02%トリトンX-100を脱イオン水に加えます。そして、胞子を削り取るために無菌ループを使用してください。
イノキュラムからピペットを取り除き、300mlの滅菌ビーカーに移します。0.02%トリトンX-100で5倍希釈を準備し、ヘモサイトメーターを使用して胞子数を計算します。必要に応じて再び希釈し、1ml当たり400万個の胞子の濃度で100mlを得る。
空のビーカーに接種を注ぎます。カーネルをスティルバー付きの滅菌300mlビーカーに入れ、3分間かき混ぜます。鉗子を使用して、カーネルをバイオアッセイ皿に移し、各キャップに1つのカーネルだけを入れるようにします。
各バイオアッセイトレイの底に30mlの脱イオン水を加えます。そして、7日間摂氏31度でインキュベートします。A.flavusで7日間の接種の後、顕微鏡分析と写真撮影のために指定された4つのカーネルの写真を撮ります。
その後、軟部組織と脱イオン水を使用して、カーネルの外面をきれいにします。カーネルの縦断面を行い、蛍光顕微鏡ですぐに写真を撮ります。分析用のカーネルを準備するには、残りのカーネルの外側を軟部組織と脱イオン水で洗浄します。
1つの担当者を構成する4つのカーネルを、2つのステンレスボールを含む15mlスクリューキャップポリカーボネートバイアルに入れる。すぐに液体窒素でバイアルを凍結し、さらなる処理と分析を進める準備ができるまで摂氏80度で保存します。準備ができたら、冷凍庫からカーネルを取り出し、ホモジナイザーを使用して1500 rpmで3分間粉砕します。
GFP分析、アフラトキシン定量、分子分析には同じ地盤材料を使用し、すべての値がサンプルを代表するようにします。少なくとも 3 つの複製が推奨されますが、良質のカーネルの可用性によっては、より良い方が常に適しています。本研究では、トウモロコシHI-II線の未熟胚は、カリフラワーモザイクウイルスから35Sプロモーターの制御下でラブラブ純粋AILP遺伝子を発現する最終植物先ベクターを含むアグロバクテリウム・トゥメファシエンスEHA101株を用いて形質転換される。
標的AILP遺伝子のPCR増幅は、トランスジェニックトウモロコシ株においてのみ観察された548bpアンプリコンを示した。AILP遺伝子はトランスジェニックラインで発現を示したのに対し、AILP発現は対照植物では認められなかった。初期の発芽胞子は、若いトランスジェニックトウモロコシ植物からの粗葉抽出物に20時間曝露される。
トランスジェニック葉抽出物に曝露された胞子からの高い全長は、陰性対照と比較して58〜80%の減少を示す。使用されるA.flavus株は、リアルタイムでの真菌の成長の監視と定量を可能にするGFPレポーターが含まれています。GFP蛍光の有意な低下は、等原性陰性対照と比較してトランスジェニックAILPカーネルにおいて観察される。
AILPライン4と5、69%および72%の真菌の成長に有意な減少が見られる。他の行は、コントロールカーネルと比較して35〜60%の減少を示しています。AILPカーネルでは、コントロールと比較して62〜88%のAILP含有量の減少が認められた。
4行目は、486 ng/gで最も低いアフラトキシン含有量を有し、その後にカーネル内のg当たり640〜1498ngの範囲の内容を有する他の行が続く。この手順に従って、フッ素計を使用してGFPを定量化し、その真菌の増殖として追加の方法を実行することができます。免疫ベースの市販キットまたはHPLCまたはEPLCは、アフラトキシン定量を行うために使用することができます。
KSAの入手可能性は、アフラトキシン汚染に対する耐性を決定する迅速かつ簡単な手段を提供します。異なるトウモロコシの繁殖ラインのこの技術を使用して迅速に評価することができます。カーネルスクリーニングアッセイは危険ではありませんが、オペレータはアスペルギルスフラヴス胞子への暴露から自分自身を保護し、適切な保護具を使用する必要があります。
