여기서 우리는 항진균 단백질을 표현하는 옥수수 커널에서 아스퍼길러스 플라부스 성장과 아플라톡신 생산을 분석하기 위해 간단한 커널 스크리닝 분석을 제시합니다. 아스퍼질러스 플라부스 균주를 표현하는 녹색 형광 단백질을 사용하여, 우리는 실시간으로 성숙한 커널에서 곰팡이의 감염과 확산을 모니터링합니다. 이 간단한 분석법은 아스퍼길러스 플라부 감염 및 아플라톡신 생산에 저항하는 옥수수 커널의 능력을 평가하는 신뢰할 수있는 수단을 제공합니다.
성숙한 커널에 통제된 조건하에서 수행된 이 실험실 분석의 결과는 필드 조건 하에서 감염의 결과와 잘 상관관계가 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 후법인 Rajtilak Majumdar 박사와 크리스틴 시틀러 및 데이비드 암브로시오(David Ambrosio) 연구실의 생물 과학 기술자이기도 합니다. 먼저 페트리 접시에 20mm 스냅 캡을 붙이면 KSA 캡을 만듭니다.
캡을 사용하기 전에 접착제를 48 시간 동안 건조시키십시오. 생물학적 안전 캐비닛에서 물에 70 %에탄올사각형 바이오 아세이 트레이를 스프레이합니다. 트레이를 공기건조시키십시오.
멸균 크로마토그래피 페이퍼를 드라이 트레이에 넣습니다. KSA 캡 9개를 70%에탄올로 스프레이하고 공기 건조시키세요. 그런 다음 생물 분석 트레이에 캡을 놓습니다.
테스트 중인 각 형질전환 옥수수 라인에 대해 손상되지 않은 커널 20개를 선택하고 50ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 탁상 스테레오 현미경을 사용하여 분석에 손상되지 않은 커널만 선택합니다. 손상된 커널은 아스퍼질러스 공격에 더 취약하고 더 많은 아플라톡신을 생성하여 결과를 왜곡하고 다양한 진정한 항진균 또는 항균 특성을 나타내지 않습니다.
각 튜브에 70%에탄올을 추가합니다. 커널을 4분 간 소독하는 동시에 가끔씩 부드럽게 흔들어 줍니다. 이 후 부드럽게 에탄올을 부어 부드럽게 멸균 된 물에 커널을 세 번 헹구십시오.
V8 배지에서 재배된 GFP를 표현하는 아스퍼길러스 플라부스 얼룩 70의 6일 문화를 획득한다. 멸균 0.02% 트리톤 X-100을 디온화 물에 20ml를 넣습니다. 그리고 포자를 긁어 멸균 루프를 사용합니다.
피펫을 접종한 후 300ml멸균 비커로 옮기습니다. 0.02%의 Triton X-100으로 5배 희석을 준비하고 혈전계를 사용하여 포자 수를 수행합니다. 필요한 경우 다시 희석하여 ml당 4백만 포자의 농도로 100ml를 얻습니다.
빈 비커에 접종을 부어. 커널을 멸균 300ml 비커에 넣고 저어주세요. 집게를 사용하여 커널을 생체 분석 접시로 옮기고 커널을 각 캡에 하나만 배치합니다.
각 바이오아세이 트레이의 바닥에 30ml의 탈이온화된 물을 넣습니다. 그리고 7 일 동안 섭씨 31도에서 배양하십시오. A.flavus와 접종7 일 후, 현미경 분석 및 사진 촬영에 지정된 네 커널의 사진을 찍어.
그런 다음 연조직과 탈이온된 물을 사용하여 커널의 외관을 청소합니다. 커널의 세로 섹션을 수행하고 즉시 형광 현미경으로 사진을 찍습니다. 분석을 위해 커널을 준비하려면 나머지 커널의 바깥쪽을 연조직과 탈온화된 물로 청소하십시오.
1개의 담당자를 구성하는 4개의 커널을 스테인리스 스틸 볼 2개가 들어 있는 15ml 스크류 캡 폴리카보네이트 바이알에 넣습니다. 액체 질소에 바이알을 즉시 동결하고 추가 처리 및 분석을 진행할 준비가 될 때까지 섭씨 80도에 보관하십시오. 준비가 되면 냉동고에서 커널을 제거하고 균질화기를 사용하여 1500 rpm에서 3 분 동안 갈아 드시면 됩니다.
모든 값이 시료를 대표할 수 있도록 GFP 분석, Aflatoxin 결정 및 분자 분석에 동일한 접지 재료를 사용합니다. 최소 세 개의 복제본을 권장하지만 양질의 커널의 가용성에 따라 항상 더 좋습니다. 이 연구에서 옥수수 HI-II 라인의 미성숙 배아는 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터 35S 프로모터의 통제하에 Lablab purpureus AILP 유전자를 발현하는 최종 식물 대상 벡터를 포함하는 Agrobacterium tumefaciens EHA101 균주를 사용하여 변형된다.
표적 AILP 유전자의 PCR 증폭은 형질전환 옥수수 라인에서만 관찰된 548bp 앰플리턴을 나타냈다. AILP 유전자는 대조군 식물에서 AILP 발현이 관찰되지 않은 반면 형질전환선에서 발현을 보였다. 초기 단계 발아 포자는 20 시간 동안 젊은 형질 전환 옥수수 식물에서 조잡한 잎 추출물에 노출됩니다.
형질전환 잎 추출물에 노출된 포자로부터의 전체 길이가 높을수록 음극에 비해 58~80% 감소한다. 사용되는 A.flavus 균주는 실시간으로 곰팡이 성장의 모니터링 및 정량화를 가능하게 하는 GFP 리포터가 포함되어 있습니다. GFP 형광의 현저한 감소는 동종 음성 대조군과 비교하여 형질전환 AILP 커널에서 관찰된다.
AILP 라인 4호선과 5호선, 69%, 72%의 성장률이 크게 감소했습니다. 다른 라인은 제어 커널에 비해 35 ~60 % 감소의 감소를 보여줍니다. 아플라톡신 함량에서 62~88%의 감소가 대조군과 비교하여 AILP 커널에서 관찰되었다.
4호선은 g당 486ng에서 가장 낮은 아플라톡신 함량을 보이며, 커널에서 g당 640~1498ng 사이의 내용이 포함된 다른 라인들이 그 뒤를 잇는 것으로 나타났습니다. 이 절차에 따라, GFP를 정량화하고 곰팡이 성장으로 불소계를 사용하는 것과 같은 추가 방법을 수행 할 수 있습니다. 면역 기반 상용 키트 또는 HPLC 또는 EPLC는 Aflatoxin 수량을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
KSA의 가용성은 Aflatoxin 오염에 대한 저항을 결정하는 빠르고 간단한 수단을 제공합니다. 다른 옥수수 사육 라인의 이 기술을 사용하여 신속하게 평가할 수 있습니다. 커널 스크리닝 분석은 위험하지 않지만, 운영자는 아스퍼길러스 플라부 포자에 노출되지 않도록 자신을 보호해야 하며 적절한 보호 장비를 사용해야 합니다.
