Здесь мы представляем простой анализ скрининга ядра для анализа роста aspergillus flavus и производства афлатоксина в ядрах кукурузы, выражающий противогрибковый белок. Используя зеленый флуоресцентный белок, выражающий штамм Aspergillus flavus, мы отслеживаем инфекцию и распространение гриба в зрелых ядрах в режиме реального времени. Этот простой анализ обеспечивает надежное средство оценки способности ядра кукурузы противостоять инфекции Aspergillus flavus и выработке афлатоксина.
Результаты этого лабораторного анализа, выполненные в контролируемых условиях на зрелых ядрах, хорошо коррелируют с результатами инфекции в полевых условиях. Демонстрация процедуры будет д-р Rajtilak Majumdar, postdoc из нашей лаборатории, наряду с Кристин Sickler и Дэвид Амбросио, биологические науки техников также из нашей лаборатории. Для начала, клей 20 двух мм оснастки шапки в чашке Петри для создания KSA шапки.
Пусть клей высохнуть в течение 48 часов, прежде чем использовать крышки. В биологической безопасности шкаф спрей квадратный биоанализ лоток с 70% этанола в воде. Дайте подносу высохнуть.
Добавьте стерильную хроматографическую бумагу в сухой лоток. Спрей девять из KSA шапки с 70%этанола и дайте им высохнуть. Затем поместите колпачки на поднос биоанализа.
Для каждой трансгенной линии кукурузы, тестируют, выберите 20 неповрежденных ядер и поместите их в 50 мл центрифуги трубки. Используя настольный стерео микроскоп, выберите только неповрежденные ядра для анализа. Поврежденные ядра более восприимчивы к атаке Аспергиллуса и производят больше афлатоксина, тем самым искажая результаты и не представляя истинные противогрибковые или противомикробные черты сорта.
Добавьте 70% этанола в каждую трубку. Пусть ядра стерилизовать в течение четырех минут, а иногда и мягко встряхивая их. После этого аккуратно слейте этанол и аккуратно промойте ядра в стерильной деионизированной воде три раза.
Получить шестидневную культуру Aspergillus flavus пятно 70 выражая GFP выросли на V8 среды. Добавьте 20 мл стерильной 0,02%Triton X-100 в деионизированную воду. И использовать стерильную петлю, чтобы соскребать споры.
Пипетка с инокулума и передать его в 300 мл стерильного стакана. Приготовьте пятикратное разбавление 0,02%Triton X-100 и используйте гемоцитометр для выполнения подсчета спор. Разбавить снова, если это необходимо, чтобы получить 100 мл с концентрацией четыре миллиона спор на мл.
Слейте инокулум в пустой стакан. Поместите ядра в стерильный стакан 300 мл с баром для перемешивания и перемешайте в течение трех минут. Используя типсы, перенесите ядра в блюдо bioassay, убедившись, что поместите только одно ядро в каждую крышку.
Добавьте 30 мл деионизированной воды на дно каждого лотка биоанализа. И инкубировать при 31 градусе по Цельсию в течение семи дней. После семи дней прививки с A.flavus, сфотографировать четыре ядра, которые были назначены для микроскопического анализа и фотографии.
Затем используйте мягкую ткань и деионизированную воду для очистки внешней поверхности ядер. Выполните продольные секции ядер и сразу же сделайе фотографии под флуоресцентным микроскопом. Чтобы подготовить ядра к анализу, очистите внешние части оставшихся ядер мягкой тканью и деионизированной водой.
Поместите четыре ядра, которые составляют один респ, в 15 мл винт крышка поликарбонат флакон, содержащий два шара из нержавеющей стали. Немедленно заморозить флаконы в жидком азоте и хранить при 80 градусах по Цельсию, пока не будет готов приступить к дальнейшей обработке и анализу. Когда он будет готов, удалите ядра из морозильной камеры и используйте гомогенизатор, чтобы измельчить их при 1500 об/мин в течение трех минут.
Используйте те же наземные материалы для анализа GFP, определения афлатоксина и молекулярного анализа, чтобы все значения были репрезентативными для образцов. Хотя рекомендуется как минимум три репликации, больше всегда лучше в зависимости от наличия ядер хорошего качества. В этом исследовании незрелые эмбрионы кукурузы HI-II линии преобразуются с помощью Agrobacterium tumefaciens EHA101 штамм, содержащий конечный вектор назначения растений, выражающих lablab purpureus AILP гена под контролем 35S промоутер из вируса мозаики цветной капусты.
Усиление ПЦР целевого гена AILP показало 548 bp ампликон, наблюдаемый только в трансгенных линиях кукурузы. Ген AILP показал экспрессию в трансгенных линиях, в то время как в контрольных растениях не наблюдалось экспрессии АИЛП. Ранняя стадия прорастания спор подвергаются воздействию экстрактов сырого листа из молодых трансгенных растений кукурузы в течение 20 часов.
Высокая полная длина спор, подверженных трансгенным экстрактам листьев, показывает снижение на 58-80% по сравнению с отрицательным контролем. Используемый штамм A.flavus содержит репортера GFP, который позволяет осуществлять мониторинг и количественную оценку грибкового роста в режиме реального времени. Значительное снижение флуоресценции GFP наблюдается в трансгенных ядрах АИЛП по сравнению с изогенным отрицательным контролем.
Значительное снижение наблюдается в грибковых роста для линий AILP четыре и пять, 69% и 72% соответственно. Другие линии показывают снижение на 35-60% по сравнению с ядрами управления. Снижение содержания афлатоксина в ядрах АИЛП было отмечено на 62-88% по сравнению с контролем.
Линия 4, как представляется, имеет самое низкое содержание афлатоксина на уровне 486 нг на г, а затем другие линии, которые имели содержание в диапазоне от 640 до 1498 нг на г в ядрах. После этой процедуры, дополнительные методы могут быть выполнены, такие как использование флюорометра для количественной оценки GFP и как его грибковый рост. Иммунобазированные коммерческие комплекты или HPLC или EPLC могут быть использованы для выполнения количественной оценки афлатоксина.
Наличие KSA обеспечивает быстрое и простое средство определения устойчивости к загрязнению афлатоксином. Различные линии разведения кукурузы можно быстро оценить с помощью этой техники. Хотя анализ скрининга ядра не опасен, оператор должен защитить себя от воздействия спор Aspergillus flavus, использовать надлежащее защитное оборудование.
