Burada aspergillus flavus büyümesini ve mısır çekirdeklerinde antifungal proteini ifade eden aflatoksin üretimini analiz etmek için basit bir çekirdek tarama analizi salıyoruz. Aspergillus flavus suşunu ifade eden yeşil floresan protein kullanarak mantarın enfeksiyonuve olgun çekirdeklerde yayılmasını gerçek zamanlı olarak izliyoruz. Bu basit tsay, mısır çekirdeğinin Aspergillus flavus enfeksiyonuna ve Aflatoksin üretimine karşı dayanıklılığını değerlendirmek için güvenilir bir araç sağlar.
Olgun çekirdekler üzerinde kontrollü koşullar altında yapılan bu laboratuvar tahlil sonuçları iyi alan koşulları altında enfeksiyon sonuçları ile ilişkilidir. Prosedürü gösteren Dr.Rajtilak Majumdar, bizim laboratuvar bir postdoc, Christine Sickler ve David Ambrosio ile birlikte, biyolojik bilim teknisyenleri de bizim laboratuvardan olacaktır. Başlamak için, ksa kapaklar oluşturmak için bir Petri kabında tutkal 20 iki mm snap kapaklar.
Tutkal kapaklar kullanmadan önce 48 saat kurumasını bekleyin. Biyolojik bir güvenlik kabininde suda %70 etanol içeren kare bir biyoassay tepsisi püskürtülür. Tepsinin havası kurusun.
Kuru tepsiye steril kromatografi kağıdı ekleyin. %70 etanol ile KSA kapaklarının dokuzunu püskürtün ve havanın kurumasını bekleyin. Sonra bioassay tepsiye kapaklar yerleştirin.
Test edilen her transgenik mısır hattı için 20 adet hasarsız çekirdek seçin ve bunları 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Bir masa üstü stereo mikroskop kullanarak sadece zarar görmemiş çekirdekleri titreşme için seçin. Hasarlı çekirdekler Aspergillus saldırısına daha yatkındır ve daha fazla Aflatoksin üretir, bu nedenle sonuçları çarpıtarak ve çeşitliliğin gerçek antifungal veya antimikrobiyal özelliklerini temsil etmez.
Her tüpe %70 etanol ekleyin. Ara sıra yavaşça sallayarak çekirdekleri dört dakika sterilize edelim. Bu yavaşça etanol dökün ve yavaşça steril deiyonize su çekirdekleri durulayın sonra üç kez.
V8 ortamda yetiştirilen GFP ifade Eden 70 Adet Aspergillus flavus lekesi altı günlük bir kültür elde edin. Deiyonize suya 20 ml steril %0.02 Triton X-100 ekleyin. Ve sporları kazımak için steril bir döngü kullanın.
İnokül kapalı Pipet ve 300 ml steril bir kabına aktarın. %0.02 Triton X-100 ile beş kat seyreltme hazırlayın ve spor sayımı yapmak için hemositometre kullanın. Ml başına dört milyon spor konsantrasyonu ile 100 ml elde etmek için gerekirse tekrar seyreltin.
Boş bir kabın içine inoculum dökün. Steril bir 300 ml kabıiçine çekirdekleri yerleştirin bir karıştırma çubuğu ile ve üç dakika karıştırın. Forceps kullanarak bioassay çanak çekirdekleri transfer, her kap içine sadece bir çekirdek yerleştirmek için emin olun.
Her bioassay tepsisinin altına 30 ml deiyonize su ekleyin. Ve 7 gün boyunca 31 derecede kuluçkaya yattı. A.flavus ile aşı yedi gün sonra, mikroskobik analiz ve fotoğraf için belirlenmiş dört çekirdekleri fotoğraf çekmek.
Sonra çekirdeklerin dış temizlemek için yumuşak bir doku ve deiyonize su kullanın. Çekirdeklerin uzunlamasına bölümlerini gerçekleştirin ve hemen floresan mikroskop altında fotoğraf çekin. Çekirdekleri analize hazırlamak için kalan çekirdeklerin dışını yumuşak bir doku ve deiyonize su ile temizleyin.
Bir rep oluşturan dört çekirdekleri, iki paslanmaz çelik topları içeren 15 ml vidalı kapak polikarbonat şişe içine yerleştirin. Hemen sıvı azot şişeleri dondurmak ve daha fazla işleme ve analiz ile devam etmeye hazır olana kadar 80 santigrat derece saklayın. Hazır olduğunuzda, çekirdekleri dondurucudan çıkarın ve 1500 rpm'de üç dakika boyunca öğütmek için bir homogenizer kullanın.
Tüm değerlerin numuneleri temsil edilebilmeleri için GFP analizi, Aflatoksin tayini ve moleküler analiz için aynı zemin malzemelerini kullanın. En az üç çoğaltma önerilirken, kaliteli çekirdeklerin kullanılabilirliğine bağlı olarak daha fazlası her zaman daha iyidir. Bu çalışmada maize HI-II hatlarının olgunlaşmamış embriyoları, karnabahar mozaik virüsünden 35S organizatörü kontrolü altında Lablab purpureus AILP genini ifade eden son bitki hedef vektörü içeren Agrobacterium tumefaciens EHA101 suşu kullanılarak dönüştürülür.
Hedef AILP geninin PCR amplifikasyonunda sadece transgenik mısır hatlarında gözlenen 548 bp amplikon bulundu. AILP geni transgenik hatlarda ekspresyon gösterirken kontrol tesislerinde AILP ekspresyonu gözlenmedi. Erken evre çimlenme sporları 20 saat boyunca genç transgenik mısır bitkilerinden ham yaprak ekstrelerine maruz kalır.
Transgenik yaprak ekstrelerine maruz kalan sporlardan kaynaklanan yüksek tam uzunluk, negatif kontrole göre %58-80 oranında azalma göstermektedir. Kullanılan A.flavus suşu, mantar büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini ve ölçülmesini sağlayan bir GFP muhabiri içerir. Transgenik AILP çekirdeklerinde izojenik negatif kontrole göre GFP floresansında anlamlı azalma gözlenmektedir.
AILP hatları için mantar büyümesinde sırasıyla %4 ve 5, %69 ve %72'de önemli bir azalma görülmektedir. Diğer satırlar kontrol çekirdeklerine kıyasla %35 ila %60 oranında azalma gösterir. AILP çekirdeklerinde kontrole göre Aflatoksin içeriğinde %62-88'lik bir azalma gözlendi.
Dördüncü satırda g başına 486 ng ile en düşük Aflatoksin içeriğine sahip olduğu görülürken, onu çekirdeklerde g başına 640 ile 1498 ng arasında değişen diğer satırlar takip eder. Bu prosedürü takiben, GFP'yi ölçmek için florometre kullanmak ve mantar büyümesi gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir. Aflatoksin kantitasyonunu gerçekleştirmek için immün tabanlı ticari kitler veya HPLC veya EPLC kullanılabilir.
KSA'nın kullanılabilirliği, aflatoksin kontaminasyonuna karşı direnci belirlemede hızlı ve basit bir araç sağlar. Farklı mısır ıslah hatları bu teknik kullanılarak hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. Çekirdek tarama töztehlikeli olmasa da, operatör kendini Aspergillus flavus sporlarına maruz kalmaktan korumalı, uygun koruyucu ekipman kullanmalıdır.
