Ici, nous présentons un essai simple de criblage de noyau pour analyser la croissance de flavus d’Aspergillus et la production d’Aflatoxin dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique. À l’aide d’une protéine fluorescente verte exprimant la souche Aspergillus flavus, nous surveillons l’infection et la propagation du champignon dans les grains matures en temps réel. Ce simple test fournit un moyen fiable d’évaluer la capacité du grain de maïs à résister à l’infection d’Aspergillus flavus et à la production d’Aflatoxin.
Les résultats de cet essai de laboratoire effectués dans des conditions contrôlées sur les grains matures sont en bonne corrélation avec les résultats de l’infection dans des conditions de champ. Le Dr Rajtilak Majumdar, postdoc de notre laboratoire, ainsi que Christine Sickler et David Ambrosio, techniciens en sciences biologiques également de notre laboratoire, démontreront la procédure. Pour commencer, collez des bouchons de 20 deux mm dans une boîte de Pétri pour créer des bouchons KSA.
Laisser sécher la colle pendant 48 heures avant d’utiliser les bouchons. Dans une armoire de sécurité biologique pulvériser un plateau de bioassay carré avec 70% d’éthanol dans l’eau. Laisser sécher l’air du plateau.
Ajouter du papier chromatographie stérile au plateau sec. Vaporisez neuf des bouchons KSA avec 70% d’éthanol et laissez-les sécher à l’air libre. Ensuite, placez les bouchons sur le plateau de bioassay.
Pour chaque lignée de maïs transgénique testée, sélectionnez 20 grains intacts et placez-les dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. À l’aide d’un microscope stéréo de table, sélectionnez uniquement les grains intacts pour l’analyse. Les grains endommagés sont plus sensibles à l’attaque d’Aspergillus et produisent plus d’Aflatoxine, faussant ainsi les résultats et ne représentant pas les véritables traits antifongiques ou antimicrobiens de la variété.
Ajouter 70 % d’éthanol à chaque tube. Laissez les grains stériliser pendant quatre minutes tout en les secouant parfois doucement. Après cela, versez doucement l’éthanol et rincez doucement les grains dans de l’eau désionisée stérile trois fois.
Obtenez une culture de six jours d’Aspergillus flavus tache 70 exprimant GFP cultivé sur V8 moyen. Ajouter 20 ml d’eau déionisée de 0,02 % Triton X-100 dans l’eau déionisée. Et utilisez une boucle stérile pour gratter les spores.
Pipette hors de l’inoculum et le transférer à un bécher stérile de 300 ml. Préparez une dilution quintuple avec 0,02 % de Triton X-100 et utilisez un hémocytomètre pour effectuer un nombre de spores. Diluer à nouveau si nécessaire pour obtenir 100 ml avec une concentration de quatre millions de spores par ml.
Verser l’inoculum dans un bécher vide. Placer les grains dans un bécher stérile de 300 ml à l’aide d’une barre remuer et remuer pendant trois minutes. À l’aide de forceps transférer les grains dans le plat de bioassay, en s’assurant de ne placer qu’un seul noyau dans chaque bouchon.
Ajouter 30 ml d’eau déionisée au fond de chaque plateau de bioassay. Et incuber à 31 degrés Celsius pendant sept jours. Après sept jours d’inoculation avec A.flavus, prenez des photos de quatre grains qui ont été désignés pour l’analyse microscopique et la photographie.
Ensuite, utilisez un tissu mou et de l’eau déionisée pour nettoyer l’extérieur des grains. Effectuez des sections longitudinales de grains et prenez immédiatement des photos au microscope fluorescent. Pour préparer les grains à l’analyse, nettoyez l’extérieur des grains restants avec un tissu mou et de l’eau déionisée.
Placer quatre grains, qui constituent un représentant, dans un flacon de polycarbonate de 15 ml contenant deux boules d’acier inoxydable. Congelez immédiatement les flacons dans de l’azote liquide et conservez-les à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à procéder à un traitement et à une analyse plus poussées. Une fois prêts, retirer les grains du congélateur et utiliser un homogénéiseur pour les moudre à 1500 rpm pendant trois minutes.
Utilisez les mêmes matériaux au sol pour l’analyse GFP, la détermination de l’aflatoxine et l’analyse moléculaire, de sorte que toutes les valeurs soient représentatives des échantillons. Alors qu’un minimum de trois répliques sont recommandées, plus est toujours mieux en fonction de la disponibilité de grains de bonne qualité. Dans cette étude, des embryons immatures de lignées hi-II de maïs sont transformés à l’aide de la souche AGRObacterium tumefaciens EHA101 contenant le vecteur final de destination végétale exprimant le gène Lablab purpureus AILP sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.
L’amplification pcr du gène AILP cible a montré un amplicon de 548 bp observé seulement dans les lignées transgéniques de maïs. Le gène AILP a montré l’expression dans les lignes transgéniques tandis qu’aucune expression d’AILP n’a été observée dans les usines témoins. Les spores germinantes à un stade précoce sont exposées à des extraits bruts de feuilles provenant de jeunes plants de maïs transgénique pendant 20 heures.
La pleine longueur élevée des spores exposées aux extraits transgéniques de feuille montrent une réduction de 58 à 80% comparée au contrôle négatif. La souche A.flavus utilisée contient un journaliste GFP qui permet la surveillance et la quantification de la croissance fongique en temps réel. Une réduction significative de la fluorescence de GFP est observée dans les grains transgéniques d’AILP comparés au contrôle négatif isogenic.
Une réduction significative est observée dans la croissance fongique pour les lignes AILP quatre et cinq, 69% et 72%respectivement. Les autres lignes montrent une réduction de 35 à 60% par rapport aux grains de commande. Une réduction de 62 à 88 % de la teneur en aflatoxine a été observée dans les grains de l’AILP par rapport au contrôle.
La ligne quatre est considérée comme la plus faible teneur en aflatoxine à 486 ng par g, suivie par d’autres lignes dont le contenu se situe entre 640 et 1498 ng par g dans les grains. Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être effectuées, comme l’utilisation d’un fluoromètre pour quantifier le GFP et sa croissance fongique. Les kits commerciaux immunobasés ou HPLC ou EPLC peuvent être utilisés pour effectuer la quantitation de l’Aflatoxin.
La disponibilité de KSA fournit un moyen rapide et simple de déterminer la résistance à la contamination par l’aflatoxine. Les différentes lignées de reproduction du maïs peuvent être évaluées rapidement à l’aide de cette technique. Bien que l’analyse de criblage du noyau ne soit pas dangereuse, l’opérateur doit se protéger contre l’exposition aux spores d’Aspergillus flavus, utiliser un équipement de protection approprié.
