Aqui apresentamos um simples ensaio de triagem de grãos para analisar o crescimento do flavus Aspergillus e a produção de Aflatoxinas em grãos de milho expressando uma proteína antifúngica. Usando uma proteína fluorescente verde expressando a cepa de flavus Aspergillus, monitoramos a infecção e a disseminação do fungo em grãos maduros em tempo real. Este simples ensaio fornece um meio confiável de avaliar a capacidade do grão de milho de resistir à infecção por flavus Aspergillus e à produção de Aflatoxinas.
Os resultados deste ensaio laboratorial realizados em condições controladas em núcleos maduros correlacionam-se bem com os resultados da infecção em condições de campo. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Rajtilak Majumdar, um pós-doutor do nosso laboratório, juntamente com Christine Sickler e David Ambrosio, técnicos de ciências biológicas também do nosso laboratório. Para começar, cole 20 tampas de dois mm em uma placa de Petri para criar tampas KSA.
Deixe a cola secar por 48 horas antes de usar as tampas. Em um armário de segurança biológica pulverizar uma bandeja de bioensa de ensaio quadrado com 70% de etanol na água. Deixe a bandeja secar.
Adicione papel cromatógrafo estéril à bandeja seca. Pulverizar nove das tampas KSA com 70% de etanol e deixá-los secar. Em seguida, coloque as tampas na bandeja de bioensa.
Para cada linha de milho transgênico que está sendo testada, selecione 20 grãos não danificados e coloque-os em um tubo de centrífuga de 50 ml. Usando um microscópio estéreo de mesa selecione apenas núcleos não danificados para o ensaio. Os grãos danificados são mais suscetíveis ao ataque de Aspergillus e produzem mais Aflatoxina, distorcendo assim os resultados e não representando os verdadeiros traços antifúngicos ou antimicrobianos da variedade.
Adicione 70% de etanol a cada tubo. Deixe os grãos esterilizar por quatro minutos enquanto ocasionalmente agitam-nos suavemente. Depois disso despeje suavemente o etanol e enxágue suavemente os grãos em água deionizada estéril três vezes.
Obtenha uma cultura de seis dias de Aspergillus flavus stain 70 expressando GFP cultivado em meio V8. Adicione 20 ml de estéril 0,02% Triton X-100 em água deionizada. E use um laço estéril para raspar os esporos.
Pipeta fora do inóculo e transferi-lo para um béquer estéril de 300 ml. Prepare uma diluição de cinco vezes com 0,02% Tritão X-100 e use um hemócito para realizar uma contagem de esporos. Diluir novamente se necessário para obter 100 ml com uma concentração de quatro milhões de esporos por ml.
Despeje o inóculo em um béquer vazio. Coloque os grãos em um béquer estéril de 300 ml com uma barra de mexida e mexa por três minutos. Usando fórceps transfira os grãos para o prato de bioensaio, certificando-se de colocar apenas um kernel em cada tampa.
Adicione 30 ml de água deionizada ao fundo de cada bandeja de bioensa. E incubar a 31 graus Celsius por sete dias. Após sete dias de inoculação com A.flavus, tire fotos de quatro núcleos que foram designados para análise microscópica e fotografia.
Em seguida, use um tecido mole e água deionizada para limpar o exterior dos grãos. Realize seções longitudinais de núcleos e tire imediatamente fotos sob o microscópio fluorescente. Para preparar os grãos para análise, limpe o exterior dos grãos restantes com um tecido mole e água deionizada.
Coloque quatro núcleos, que constituem um representante, em um frasco de policarbonato de tampa de parafuso de 15 ml contendo duas bolas de aço inoxidável. Congele imediatamente os frascos em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius até que esteja pronto para prosseguir com mais processamento e análise. Quando estiver pronto, retire os grãos do congelador e use um homogeneizador para moê-los a 1.500 rpm por três minutos.
Use os mesmos materiais terrestres para análise de GFP, determinação de Aflatoxina e análise molecular, para que todos os valores sejam representativos das amostras. Embora um mínimo de três réplicas sejam recomendadas, mais é sempre melhor dependendo da disponibilidade de grãos de boa qualidade. Neste estudo, embriões imaturos de linhas HI-II de milho são transformados usando tumefaciens agrobacterium EHA101 contendo o vetor final de destino vegetal expressando o gene Lablab purpureus AILP sob o controle do promotor 35S do vírus do mosaico de couve-flor.
A amplificação pcr do gene AILP alvo mostrou um amplicon de 548 bp observado apenas nas linhas de milho transgênico. O gene AILP mostrou expressão nas linhas transgênicas, enquanto nenhuma expressão AILP foi observada nas plantas de controle. Esporos germinadores em estágio inicial são expostos a extratos de folhas brutas de plantas de milho transgênicos jovens por 20 horas.
O alto comprimento total dos esporos expostos a extratos de folhas transgênicas mostram uma redução de 58 a 80% em relação ao controle negativo. A cepa A.flavus usada contém um repórter GFP que permite o monitoramento e quantificação do crescimento fúngico em tempo real. Uma redução significativa da fluorescência GFP é observada nos núcleos AILP transgênicos em comparação com o controle negativo isogênico.
Uma redução significativa é observada no crescimento fúngico das linhas AILP quatro e cinco, 69% e 72%, respectivamente. As outras linhas mostram uma redução de 35 a 60% em relação aos núcleos de controle. Observou-se redução de 62 a 88% no teor de Aflatoxina nos núcleos AILP em comparação com o controle.
A linha quatro é vista com o menor teor de Aflatoxina em 486 ng por g, seguida por outras linhas que tinham conteúdos que variavam entre 640 e 1498 ng por g nos núcleos. Após este procedimento, métodos adicionais podem ser realizados, como o uso de um fluorômetro para quantificar o GFP e como seu crescimento fúngico. Kits comerciais de imunobassados ou HPLC ou EPLC podem ser usados para realizar a quantitação de Aflatoxina.
A disponibilidade de KSA fornece um meio rápido e simples de determinar a resistência à contaminação por Aflatoxinas. As diferentes linhas de reprodução de milho podem ser avaliadas rapidamente usando essa técnica. Embora o ensaio de triagem do kernel não seja perigoso, o operador deve proteger a si mesmo da exposição aos esporos aspergillus flavus, usar equipamento de proteção adequado.
