私たちの方法の重要性は、その汎用性と効力です。これにより、研究者は既存の方法を使用して達成することが困難であった方法で内因性遺伝子発現を堅牢に制御することができます。これは、研究者が様々な発現レベルで、時空間的な方法で遺伝子の機能を調査することができます。
したがって、疾患関連遺伝子を研究する際に有用である表現型の可逆性を試験することができます。抑制を達成するために、標的遺伝子イントロンは、12の対称Lacオペレータを含むレプロンRを含むように設計される。LacIGYリプレッサーが所望の組織特異的プロモーターから発現されると、標的遺伝子は抑制される。
標的遺伝子の抑制は、LacIGYリプレッサーのアンタゴニストであるIPTGの投与により、所望の発現レベルに逆転または調整することができる。アップレギュレーションを達成するために、標的遺伝子プロモーターは、rtTA-M2活性化剤の結合部位として4つ以上のTatオペレータTを含むように設計される。活性化剤がドキシサイクリンの存在下で所望の組織特異的プロモーターから発現されると、標的遺伝子のアップレギュレーションが誘発される。
標的遺伝子のアップレギュレーションは、ドキシサイクリンの濃度を引き出すかまたは変化させることによって、所望の発現レベルに逆転または調整することができる。抑制と活性化の両方を達成するために、Lacリプレッサーとタットアクチベーターシステムを組み合わせてもよい。抑制のために目的の遺伝子を改変するために、転写的に不活性なイントロンは、対象遺伝子の5つのプライムエンドに向かって、レプロン配列の挿入のために同定されるべきである。
目的の遺伝子のゲノム配列を取得するには、UCSCゲノムブラウザに移動し、ゲノムタブの下でマウスゲノムの最新のドラフトを選択します。検索バーに対象遺伝子の名前またはシンボルを入力して、遺伝子のトランスクリプトを表示し、[移動] をクリックします。次に、目的の遺伝子に対して目的の転写変異体を選択し、対象の転写変異体の横にある遺伝子シンボルをクリックします。
次に、シーケンスとツールとデータベースへのリンクのバナーの下で、ゲノムシーケンスリンクをクリックします。シーケンス検索領域のオプションでは、エキソン、イントロン、および遺伝子ごとにデフォルトのFASTAレコードを1つ選択します。シーケンス形式オプションの場合は、大文字でエキソンを選択し、それ以外はすべて小文字で、マスクは N. に繰り返し表示され、[送信] をクリックします。
最後に、このシーケンスを保存し、説明を付けることができる文書またはプログラムの大文字と小文字の書式を保持します。CpG島の中断を避けるために、UCSCゲノムブラウザの発現と調節バナーの下にあるCpG諸島トラックのショーを選択し、リフレッシュをクリックします。5つの素数イントロンをズームインし、緑色で表示された各CpG島をクリックし、この機能のビューDNAを選択します。
マスクを選択した後、Nに繰り返し、CpG島列を取得するDNAを取得をクリックします。最後に、これらのシーケンスを元のシーケンスファイルにオーバーレイし、これらを避けるべきイントロニック領域としてアポイントします。目的の組織にエンハンサー シグネチャを持つイントロニック領域を回避するには、ENCODE データベースに移動し、実験アイコンを選択します。
アッセイタイプとして、ChiP-seqまたはDNase-seqを選択し、操作するセルに従って他のカテゴリを設定します。フィーチャの選択後、最も左側の絵文字を青色で選択し、結果をリストとして表示します。次に、h3k4モノメチル化、h3k27アセチル化、DNase1、およびCTCFの標的に対して、操作する細胞に最も近いデータセットを選択します。
各関連データ セット内で、ファイル セクションまでスクロールし、mm10 と UCSC が選択されていることを確認して、[視覚化] ボタンをクリックします。UCSCゲノムブラウザで、5つのプライムイントロンを拡大し、コメント付きのピークトラックの各ピークをクリックします。各ピークの染色体座標をクリックして、各ピーク領域のDNA配列を取得します。
ビュードロップダウンメニューで[DNA]を選択し、[マスクの繰り返し]をクリックし、最後に、これらのシーケンスを元のシーケンスファイルにオーバーレイし、これらを避けるイントロニック領域としてコメントします。高い特異性と予測効率スコアを持つ残りのイントロニック領域のsgRNAを同定するには、CRISPORなどのオンラインsgRNA設計ツールにナビゲートします。目的のイントロニック領域の配列を入力し、関連する参照ゲノムを指定し、目的のプロトスペーサー隣接モチーフを選択します。
次に、[送信] をクリックします。次に、予測されたsgRNAを特異性スコアでソートし、高い予測効率スコアを有する1つ以上のsgRNAを選択する。最後に、sgRNA切断部位に対応する60塩基相同の腕で両側に横たわるPITT着陸パッド配列を含むDNAテンプレートを設計する。
標的遺伝子抑制の逆転のために、投与日に所望量のIPTGを滅菌蒸留水に完全に溶解させることにより、目的の改変対立遺伝子を有するホモ接合性マウスの飲料水中にIPTGを投与する。ボトルをホイルで包み、IPTG水を軽く保護されたボトルに入れ、適切な遺伝子型のマウスに投与し、少なくとも1週間コントロールします。標的組織における目的の遺伝子の発現の解析に進む。
遺伝子をアップレギュレーションに誘導するために、1週間の食事療法でドキシサイクリンを投与し、標的組織における目的の遺伝子の発現の解析に進む。qRT PCRアニリスは、プロモーターベースのアプローチを用いてDNMT1発現が非規制レベルの15%に抑圧されたことを示した。抑制は、様々な量のIPTGを有するマウスを治療することによって用量依存的に逆転した。
観察されたDNMT1抑制とIPTG治療によるDNMT1抑制の逆転は、免疫染色によってタンパク質レベルで検証された。mKate2発現のqRT PCR解析は、イントロンベースのアプローチが転写伸長を減衰させることによって転写開始部位の数キロベース下にあるオペレータから90%以上の抑制を達成したことを示した。LacIGYリプレッサーの有無にかかわらずマウスの小さなインテンスチントにおけるmKate2発現の共焦点画像は、イントロンベースのアプローチを検証した。
DNMT1発現の堅牢なアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションは、TatおよびLacオペレータ配列を有する修飾内因性DNMT1アレスレを含む胚性幹細胞において達成された。両方の規制は完全に可逆的であり、IPTGおよびDox治療によって誘導可能であった。DNMT1の強力なアップレギュレーションは、肝臓、脾臓、および腎臓から観察された。
しかし、心臓では検出可能なアップレギュレーションは見られず、DMNT1の細胞周期依存発現パターンと心臓の増殖細胞の希少性がこの観察の根源となり得る可能性が示唆された。その発現を操作することによって重要な遺伝子の生体内機能を研究することは、しばしば致死性のために困難であった。我々の方法は、我々の関心のある遺伝子の致死的表現型を克服することを可能にし、我々は生体内の腫瘍発生におけるその役割を研究することを可能にした。
同様に、この技術は、研究が困難であった他の必須遺伝子の調査を可能にします。
