Die Bedeutung unserer Methode ist ihre Vielseitigkeit und Potenz. Es ermöglicht Forschern eine robuste Kontrolle über die endogene Genexpression in einer Weise, die mit bestehenden Methoden schwierig zu erreichen war. Es ermöglicht Forschern, die Funktion eines Gens auf verschiedenen Expressionsebenen und auf räumlich-zeitliche Weise zu untersuchen.
So ermöglicht es, die Reversibilität eines Phänotyps zu testen, was beim Studium von krankheitsbedingten Genen nützlich ist. Um Repression zu erreichen, wird das Zielgen Intron entwickelt, um Repron R zu enthalten, das 12 symmetrische Lac-Operatoren enthält. Wenn der LacIGY-Repressor vom gewünschten gewebespezifischen Promotor exprimiert wird, wird das Zielgen unterdrückt.
Die Unterdrückung des Zielgens kann durch Verabreichung von IPTG, einem Antagonisten des LacIGY-Repressors, umgekehrt oder an die gewünschte Expressionsstufe angepasst werden. Um eine Upregulation zu erreichen, ist der Zielgenpromotor so konzipiert, dass er vier oder mehr Tat-Operatoren, T, als Bindungsstellen für die rtTA-M2-Aktivatoren enthält. Wenn der Aktivator vom gewünschten gewebespezifischen Promotor in Gegenwart von Doxycyclin exprimiert wird, wird eine Upregulation des Zielgens induziert.
Die Upregulation des Zielgens kann umgekehrt oder an die gewünschte Expressionsstufe angepasst werden, indem die Konzentration von Doxycyclin zurückgezogen oder verändert wird. Um sowohl Repression als auch Aktivierung zu erreichen, können die Lac-Repressor- und Tat-Aktivatorsysteme kombiniert werden. Um das Gen von Interesse für Repression zu modifizieren, sollte ein transkriptionsweise inertes Intron in Richtung des fünf Hauptendes des Gens von Interesse für die Einfügung der Repron-Sequenz identifiziert werden.
Um die genomische Sequenz für das gen von Interesse zu erhalten, navigieren Sie zum UCSC-Genombrowser und wählen Sie den neuesten Entwurf des Mausgenoms unter der Registerkarte Genome aus. Geben Sie den Namen oder das Symbol des gens von Interesse in die Suchleiste ein, um die Transkripte für das Gen anzuzeigen, und klicken Sie dann auf "Gehen". Wählen Sie dann die gewünschte Transkriptvariante für das gen von Interesse aus und klicken Sie auf das Gensymbol neben der Transkriptvariante von Interesse.
Als nächstes, unter der Sequenz und Links zu Werkzeugen und Datenbanken Banner, klicken Sie auf die genomische Sequenz Link. Wählen Sie für Sequenzabrufbereichsoptionen nur Exons, Introns und den standardmäßigen FASTA-Datensatz pro Gen aus. Um Formatierungsoptionen zu sequenzieren, wählen Sie Exons in Großbuchstaben, alles andere in Kleinbuchstaben und Maskenwiederholungen an N.Dann klicken Sie auf Absenden.
Speichern Sie schließlich diese Sequenz, wobei die Groß- und Kleinschreibung in einem Dokument oder Programm beibehalten wird, das mit Anmerkungen beschriftet werden kann. Um eine Unterbrechung der CpG-Inseln zu vermeiden, wählen Sie show for the CpG islands track unter dem Ausdrucks- und Regelbanner des UCSC-Genombrowsers aus und klicken Sie auf Aktualisieren. Wenn Sie auf die fünf Prime-Introns zoomen, klicken Sie auf jede grün dargestellte CpG-Insel, und wählen Sie DNA für diese Funktion anzeigen aus.
Nachdem Sie die Maskenwiederholungen auf N ausgewählt haben, klicken Sie auf DNA abrufen, um die Sequenz der CpG-Inseln zu erhalten. Schließlich überlagern Sie diese Sequenzen mit der ursprünglichen Sequenzdatei und kommentieren Diese als intronic-Regionen, um diese zu vermeiden. Um intronic-Regionen mit Enhancer-Signaturen in den geweben von Interesse zu vermeiden, navigieren Sie zur ENCODE-Datenbank und wählen Sie das Experimentsymbol aus.
Wählen Sie für den Assay-Typ ChiP-seq oder DNase-seq aus, und füllen Sie die anderen Kategorien entsprechend den zu entwickelnden Zellen aus. Wählen Sie nach der Feature-Auswahl das linke Piktogramm in blau aus, für das die Angezeigtwerden als Liste angezeigt werden. Wählen Sie dann die Datensätze für die Ziele der h3k4-Monomethylierung, h3k27-Acetylierung, DNase 1 und CTCF aus, die den zu entwickelnden Zellen am ehesten entsprechen.
Scrollen Sie in jedem relevanten Datensatz zum Dateiabschnitt, überprüfen Sie, ob mm10 und UCSC ausgewählt sind, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Visualisierung". Zoomen Sie nun im UCSC-Genombrowser auf die fünf Prime-Introns und klicken Sie auf jeden Peak in den kommentierten Peak-Tracks. Erhalten Sie die DNA-Sequenz für jeden Spitzenbereich, indem Sie auf die Chromosomenkoordinaten für jeden Peak klicken.
Wählen Sie im Dropdown-Menü Ansicht DNA aus, und klicken Sie auf Die Wiederholungen der Maske auf N.Endlich überlagern Sie diese Sequenzen mit der ursprünglichen Sequenzdatei und kommentieren diese als intronic-Bereiche, um diese zu vermeiden. Um eine sgRNA in den verbleibenden intronischen Regionen mit hoher Spezifität und vorhergesagten Effizienzwerten zu identifizieren, navigieren Sie zu einem Online-Designtool von sgRNA ihrer Wahl, wie CRISPOR. Geben Sie die Reihenfolge des intronischen Interessenbereichs ein, geben Sie das entsprechende Referenzgenom an und wählen Sie das gewünschte protospacer benachbarte Motiv aus.
Klicken Sie dann auf Absenden. Als Nächstes sortieren Sie die vorhergesagte sgRNA nach Spezifitätsbewertung und wählen Sie eine oder mehrere sgRNA es aus, die auch einen hohen vorhergesagten Effizienzwert haben. Schließlich entwerfen Sie eine DNA-Vorlage mit einer PITT-Landepad-Sequenz, die auf beiden Seiten von 60-Basis-Homologiearmen flankiert wird, die der sgRNA-Schnittstelle entsprechen.
Zur Umkehrung der Zielgenrepression IPTG im Trinkwasser der homozygot gezüchteten Mäuse mit dem modifizierten Allel von Interesse zu verabreichen, indem die gewünschte Menge an IPTG am Tag der Verabreichung vollständig in steriles destilliertes Wasser auflöst wird. Die Flasche mit Folie umwickeln und das IPTG-Wasser in einer lichtgeschützten Flasche den Mäusen des entsprechenden Genotyps und Kontrollen für mindestens eine Woche verabreichen. Analysieren Sie die Expression des Gens, das im Zielgewebe von Interesse ist.
Um die Gen-Upregulation zu induzieren, verabreichen Sie Doxycyclin in der Ernährung für eine Woche und fahren Sie mit der Analyse der Expression des Gens von Interesse im Zielgewebe. qRT PCR-Anaylisis zeigte, dass die DNMT1-Expression mit dem Promoter-basierten Ansatz auf 15 % der unregulierten Werte unterdrückt wurde. Die Repression wurde dosisabhängig durch die Behandlung von Mäusen mit unterschiedlichen Mengen an IPTG rückgängig gemacht.
Die beobachtete DNMT1-Repression und die Umkehrung der DNMT1-Repression durch IPTG-Behandlung wurde auf Proteinebene durch Immunfärbung validiert. die qRT PCR-Analyse des mKate2-Ausdrucks zeigte, dass der intron-basierte Ansatz mehr als 90% Repression von Bedienern erreichte, die mehrere Kilobasen unterhalb der Transkriptionsstartstelle durch Dämpfung der Transkriptionsdehnung lokalisierten. Konfokale Bilder des mKate2-Ausdrucks im kleinen Intenstin der Mäuse mit oder ohne LacIGY-Repressor bestätigten den Intron-basierten Ansatz.
Robuste Upregulation und Downregulation der DNMT1-Expression wurden in embryonalen Stammzellen erreicht, die das modifizierte endogene DNMT1-Allel mit Tat- und Lac-Operatorsequenzen enthalten. Beide Vorschriften waren vollständig reversibel und durch IPTG- und Dox-Behandlungen induzierbar. Starke Upregulation von DNMT1 wurde von der Leber beobachtet, Milz, und Niere.
Es wurde jedoch keine nachweisbare Upregulation im Herzen beobachtet, was darauf hindeutet, dass das zellzyklusabhängige Expressionsmuster von DMNT1 und die Knappheit proliferativer Zellen im Herzen dieser Beobachtung zugrunde liegen könnten. Die Untersuchung der In-vivo-Funktion eines kritischen Gens durch Manipulation seiner Expression war aufgrund der Letalität oft eine Herausforderung. Unsere Methode ermöglichte es uns, den tödlichen Phänotyp für unser Gen von Interesse zu überwinden und ermöglichte es uns, seine Rolle bei der Tumorogenese in vivo zu untersuchen.
Ebenso wird diese Technologie die Untersuchung anderer wesentlicher Gene ermöglichen, die schwer zu untersuchen waren.
