La importancia de nuestro método es su versatilidad y potencia. Permite a los investigadores tener un control robusto sobre la expresión génica endógena de maneras que han sido difíciles de lograr utilizando los métodos existentes. Permite a los investigadores investigar la función de un gen en varios niveles de expresión y de manera espacio-temporal.
Por lo tanto, permite probar la reversibilidad de un fenotipo, que es útil cuando se estudian genes relacionados con la enfermedad. Para lograr la represión, el gen objetivo intrón está diseñado para contener repron R, que contiene 12 operadores lac simétricos. Cuando el represor LacIGY se expresa desde el promotor específico del tejido deseado, el gen objetivo se reprime.
La represión del gen objetivo puede revertirse o ajustarse al nivel de expresión deseado mediante la administración de IPTG, un antagonista del represor LacIGY. Para lograr la regulación, el promotor del gen objetivo está diseñado para contener cuatro o más operadores de Tat, T, como sitios de unión para los activadores rtTA-M2. Cuando el activador se expresa desde el promotor específico del tejido deseado en presencia de doxiciclina, se induce la regulación ascendente del gen objetivo.
La regulación del gen objetivo se puede invertir o ajustar al nivel de expresión deseado retirando o alterando la concentración de doxiciclina. Para lograr tanto la represión como la activación, se pueden combinar los sistemas de represor Lac y Activador Tat. Para modificar el gen de interés para la represión, se debe identificar un intrón transcripcionalmente inerte hacia el extremo cinco del gen de interés para la inserción de la secuencia de repron.
Para obtener la secuencia genómica del gen de interés, vaya al navegador del genoma de la UCSC y seleccione el último borrador del genoma del ratón en la pestaña Genomas. Introduzca el nombre o símbolo del gen de interés en la barra de búsqueda para ver las transcripciones del gen y, a continuación, haga clic en ir. A continuación, seleccione la variante de transcripción deseada para el gen de interés y haga clic en el símbolo genético junto a la variante de transcripción de interés.
A continuación, en el banner de secuencia y vínculos a herramientas y bases de datos, haga clic en el vínculo de secuencia genómica. Para las opciones de región de recuperación de secuencia, seleccione solo exones, intrones y el registro FASTA predeterminado por gen. Para las opciones de formato de secuenciación, seleccione exones en mayúsculas, todo lo demás en minúsculas y la máscara se repite en N.Then, haga clic en Enviar.
Por último, guarde esta secuencia, conservando el formato en mayúsculas y minúsculas en un documento o programa que se puede anotar. Para evitar la interrupción de las islas CpG, seleccione show para la pista de islas CpG bajo el banner de expresión y regulación del navegador del genoma UCSC y haga clic en refresh. Acercar los cinco intrones primos, haga clic en cada isla CpG que se muestra en verde y seleccione ver EL ADN para esta característica.
Después de seleccionar las repeticiones de máscara a N, haga clic en obtener ADN para obtener la secuencia de islas CpG. Por último, superponga estas secuencias con el archivo de secuencia original y anote estas como regiones intrónicas que se deben evitar. Para evitar regiones intrónicas con firmas potenciadoras en los tejidos de interés, vaya a la base de datos ENCODE y seleccione el icono de experimentos.
Para el tipo de ensayo, seleccione ChiP-seq o DNase-seq y rellene las otras categorías según las celdas que se van a diseñar. Después de la selección de la operación, seleccione el pictograma más a la izquierda en azul, para el que aparece la vista de los resultados como lista. A continuación, seleccione los conjuntos de datos para los objetivos de la monometilación h3k4, la acetilación h3k27, DNase 1 y CTCF que más se ajustan a las celdas que se van a diseñar.
Dentro de cada conjunto de datos relevante, desplácese a la sección del archivo, verifique que los mm10 y UCSC estén seleccionados, y haga clic el botón visualizar. Ahora, en el navegador del genoma UCSC, haga zoom en los cinco intrones primos y haga clic en cada pico en las pistas de pico anotadas. Obtenga la secuencia de ADN para cada región de pico haciendo clic en las coordenadas cromosómicas para cada pico.
En el menú desplegable de la vista, seleccione ADN y haga clic en máscaras repetidas en N.Finalmente, superponga estas secuencias con el archivo de secuencia original y anote estas como regiones intrónicas para evitarlas. Para identificar un sgRNA en las regiones intrínsecos restantes con alta especificidad y puntuaciones de eficiencia previstas, navegue a una herramienta de diseño de SGRNA en línea de su elección, como CRISPOR. Introduzca la secuencia de la región intrónica de interés, especifique el genoma de referencia relevante y seleccione el motivo adyacente del protoespacial.
A continuación, haga clic en Enviar. A continuación, ordene la puntuación de especificidad de sgRNA pronosticada y seleccione una o más sgRNA que también tengan una puntuación de eficiencia pronosticada alta. Por último, diseñe una plantilla de ADN que contenga una secuencia de almohadilla de aterrizaje PITT flanqueada en ambos lados por brazos homológicos de 60 bases que correspondan al sitio de corte sgRNA.
Para la reversión de la represión genética objetivo, administre IPTG en el agua potable de los ratones criados homocigotos con el alelo modificado de interés disolviendo completamente la cantidad deseada de IPTG en agua destilada estéril el día de la administración. Envuelva el frasco con papel de aluminio y administre el agua IPTG en una botella ligera protegida a los ratones del genotipo y controles apropiados durante al menos una semana. Proceder a analizar la expresión del gen de interés en el tejido objetivo.
Para inducir la regulación del gen, administre la doxiciclina en la dieta durante una semana y proceda a analizar la expresión del gen de interés en el tejido objetivo. qRT PCR anaylisis demostró que la expresión DNMT1 fue reprimida al 15% de los niveles no regulados utilizando el enfoque basado en el promotor. La represión se revirtió de manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento de ratones con cantidades variables de IPTG.
La represión DNMT1 observada y la reversión de la represión DNMT1 por el tratamiento con IPTG se validaron a nivel proteico mediante inmunosumanidad. el análisis pcR qRT de la expresión mKate2 mostró que el enfoque basado en intrón logró más del 90% de la represión de los operadores ubicados varias kilobases aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción al atenuar el alargamiento de la transcripción. Las imágenes confocales de la expresión mKate2 en la pequeña intenstina de los ratones con o sin el represor LacIGY validaron el enfoque basado en intrón.
La fuerte regulación y regulación de la expresión DNMT1 se lograron en células madre embrionarias que contenían el alelo endógeno modificado DNMT1 con secuencias de operadores Tat y Lac. Ambas regulaciones fueron totalmente reversibles e inducibles mediante tratamientos IPTG y Dox. Se observó una fuerte regulación de DNMT1 desde el hígado, el bazo y el riñón.
Sin embargo, no se observó una regulación ascendente detectable en el corazón, lo que sugiere que el patrón de expresión dependiente del ciclo celular de DMNT1 y la escasez de células proliferativas en el corazón pueden subyaver esta observación. Estudiar la función in vivo de un gen crítico manipulando su expresión a menudo ha sido un desafío debido a la letalidad. Nuestro método nos permitió superar el fenotipo letal para nuestro gen de interés y nos permitió estudiar su papel en la tumorogénesis in vivo.
Del mismo modo, esta tecnología permitirá la investigación de otros genes esenciales que han sido difíciles de estudiar.
