O significado do nosso método é sua versatilidade e potência. Permite que os pesquisadores tenham um controle robusto sobre a expressão genética endógena de maneiras que têm sido desafiadoras para alcançar usando métodos existentes. Permite que os pesquisadores investiguem a função de um gene em vários níveis de expressão e de forma espesso-temporal.
Assim, permite testar a reversibilidade de um fenótipo, o que é útil no estudo de genes relacionados à doença. Para alcançar a repressão, o gene alvo intron é projetado para conter o repron R, que contém 12 operadores de Lac simétricos. Quando o repressor LacIGY é expresso do promotor específico do tecido desejado, o gene alvo é reprimido.
A repressão do gene alvo pode ser revertida ou ajustada ao nível de expressão desejado pela administração do IPTG, um antagonista do repressor LacIGY. Para alcançar a regulação, o promotor de genes alvo é projetado para conter quatro ou mais operadores de Tat, T, como locais de vinculação para os ativadores rtTA-M2. Quando o ativador é expresso do promotor específico do tecido desejado na presença de doxiciclina, a regulação do gene alvo é induzida.
A regulação do gene alvo pode ser revertida ou ajustada ao nível de expressão desejado, retirando ou alterando a concentração de doxiciclina. Para realizar tanto a repressão quanto a ativação, os sistemas de repressor Lac e Tat podem ser combinados. Para modificar o gene de interesse para a repressão, um introna transcrição inerte para a extremidade cinco prime do gene de interesse deve ser identificado para a inserção da sequência de repron.
Para obter a sequência genômica para o gene de interesse, navegue até o navegador de genomas UCSC e selecione o último rascunho do genoma do mouse sob a guia genomas. Digite o nome ou símbolo do gene de interesse na barra de pesquisa para visualizar as transcrições do gene e, em seguida, clique em ir. Em seguida, selecione a variante de transcrição desejada para o gene de interesse e clique no símbolo genético ao lado da variante de transcrição de interesse.
Em seguida, sob a sequência e links para o banner de ferramentas e bancos de dados, clique no link de sequência genômica. Para opções de região de recuperação de sequência, selecione apenas exons, introns e o registro FASTA padrão por gene. Para sequenciar opções de formatação, selecione exons em maiústos em maiústos, tudo o mais em minúsculas e máscaras se repete para N.Then, clique em enviar.
Finalmente, salve esta sequência, preservando a formatação maiúsdia e minúscula em um documento ou programa que pode ser anotado. Para evitar a interrupção das ilhas CpG, selecione mostrar para as ilhas CpG acompanhar sob a bandeira de expressão e regulação do navegador de genoma UCSC e clicar em atualizar. Ampliando os cinco introns primos, clique em cada ilha do CpG mostrada em verde e selecione exibir DNA para este recurso.
Depois de selecionar a máscara se repete para N, clique em obter DNA para obter a sequência das ilhas CpG. Finalmente, sobreponha essas sequências com o arquivo de sequência original e anotar-nas como regiões intrônicas para evitar. Para evitar regiões intrônicas com assinaturas de aprimoramento nos tecidos de interesse, navegue até a base de dados ENCODE e selecione o ícone de experimentos.
Para o tipo de ensaio, selecione ChiP-seq ou DNase-seq e preencha as outras categorias de acordo com as células a serem projetadas. Após a seleção do recurso, selecione o pictograma mais à esquerda em azul, para o qual os resultados de visualização à medida que a lista aparece. Em seguida, selecione os conjuntos de dados para os alvos da monometilação h3k4, acetilação h3k27, DNase 1 e CTCF que mais combinavam com as células a serem projetadas.
Dentro de cada conjunto de dados relevante, role até a seção de arquivos, verifique se o mm10 e o UCSC estão selecionados e clique no botão visualizar. Agora, no navegador de genomas UCSC, amplie os cinco introns primos e clique em cada pico nas faixas de pico anotadas. Obtenha a sequência de DNA para cada região de pico clicando nas coordenadas cromossômicas para cada pico.
No menu suspenso de exibição, selecione DNA e a máscara de clique se repita para N.Finalmente, sobreponha essas sequências com o arquivo de sequência original e anote-as como regiões intrônicas para evitar. Para identificar um sgRNA nas regiões intrônicas remanescentes com alta especificidade e pontuações de eficiência previstas, navegue até uma ferramenta de design sgRNA on-line de escolha, como o CRISPOR. Digite a sequência da região de interesse intronic, especifique o genoma de referência relevante e selecione o motivo adjacente protoespaço desejado.
Em seguida, clique em enviar. Em seguida, classifique o sgRNA previsto por pontuação de especificidade e selecione um ou mais sgRNA's que também têm uma pontuação de eficiência prevista. Finalmente, projete um modelo de DNA contendo uma sequência de plataforma de pouso PITT ladeada em ambos os lados por braços de lialogia de 60 bases que correspondem ao local de corte de sgRNA.
Para a reversão da repressão genética alvo, administre o IPTG na água potável dos camundongos criados homozigos com o alelo modificado de interesse, dissolvendo totalmente a quantidade desejada de IPTG em água destilada estéril no dia da administração. Enrole a garrafa com papel alumínio e administre a água IPTG em uma garrafa leve protegida aos ratos do genótipo e controles apropriados por pelo menos uma semana. Prossiga para analisar a expressão do gene de interesse no tecido alvo.
Para induzir a regulação genética, administre a doxiciclina na dieta por uma semana e prossiga para analisar a expressão do gene de interesse no tecido alvo. qRT PCR anaylisis mostrou que a expressão DNMT1 foi reprimida a 15% dos níveis não regulamentados usando a abordagem baseada em promotores. A repressão foi revertida de forma dependente de dose, tratando camundongos com quantidades variadas de IPTG.
A repressão observada de DNMT1 e a reversão da repressão do DNMT1 pelo tratamento do IPTG foram validadas ao nível da proteína por imunossuagem. qRT PCR análise da expressão mKate2 mostrou que a abordagem baseada em intron alcançou mais de 90% de repressão dos operadores localizados várias quilobases a jusante do local de início da transcrição, atenuando o alongamento da transcrição. Imagens confocal da expressão mKate2 na pequena intenstina dos ratos com ou sem o repressor LacIGY validaram a abordagem baseada em intron.
A regulação robusta e a baixa regulação da expressão DNMT1 foram alcançadas em células-tronco embrionárias contendo o alelo Endogeno DNMT1 modificado com sequências de operadores Tat e Lac. Ambos os regulamentos foram totalmente reversíveis e induíveis pelos tratamentos IPTG e Dox. Forte regulação do DNMT1 foi observada a partir do fígado, baço e rim.
No entanto, não foi observada uma regulação detectável no coração, sugerindo que o padrão de expressão dependente do ciclo celular do DMNT1 e a escassez de células proliferativas no coração podem estar por trás dessa observação. Estudar a função in vivo de um gene crítico manipulando sua expressão tem sido muitas vezes desafiador devido à letalidade. Nosso método nos permitiu superar o fenótipo letal para nosso gene de interesse e nos permitiu estudar seu papel na tumorogênese in vivo.
Da mesma forma, essa tecnologia permitirá a investigação de outros genes essenciais que têm sido difíceis de estudar.
