シリコーン窓を鋳造および挿入するためのこの手順は、縦方向の生体内イメージングに対する技術的障壁を低下させる。私たちのプロトコルは、動物によって十分に許容される頑丈で簡単に適応可能な窓を作り出します。この技術を用いて、肝臓、膵臓、乳腺のがんや免疫細胞をイメージングしました。
最小限の調整で、多くの解剖学的位置や生物学的な質問に適応させることができます。このテクニックを初めて試す人のために、シリンジから少量の接着剤を放出する練習をしてください。接着剤を塗りすぎると、イメージングフィールドが曇り、手術領域が作業しにくくなります。
PDMSの新しく調製したシリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサンを少量、きれいな滑らかな表面に堆積させることによってシリコーン窓の鋳造を開始し、体積対面積比を調整して所望の厚さを得る。PDMSが所望の鋳造面に堆積したら、ステンレス鋼グリッドをシリコーンに軽く押し込んで、同じ組織領域を繰り返しイメージングするためのランドマークを提供する。気泡を除去し、シリコーンポリマーを脱気するために、コーティングされた表面を真空デシケーターに45分間置く。
完了したら、75〜80°Cのオーブンで45分間ポリマーを硬化させます。金型の端にポリマーをスコアリングし、鉗子を使用して、鋳造に使用した表面から硬化した窓を静かに剥がします。マウスを左側方褥瘡の位置に置きます。
剃毛した手術部位にポビドンヨウ素溶液10体積%およびエタノール70体積%を3回連続して塗布することによって、麻酔をかけたマウスを手術用に準備する。滅菌された手術野を維持するために注意を払わなければならない。次に、滅菌ハサミと鉗子を使用して、肋骨アーチの3ミリメートル下の右脇腹に10ミリメートルの切開を行います。
皮膚の1平方センチメートルのセクションを取り除き、2対目の滅菌ハサミおよび鉗子を使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを除去する。滅菌ウェルプレートに少量の外科用接着剤を堆積させ、31ゲージシリンジでそれを引き出して、画像化する領域の縁の周りの肝臓の表面に塗布し、次いで窓を所望の領域に置き、接着剤が乾燥するまで約2分間肝臓に対してしっかりと保持する。腹膜の下の窓の縁を折り畳んだ後、腹膜の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させ、鉗子で腹膜を押し下げて窓に固定する。
同様に、皮膚を押し下げる前に少量の外科用接着剤を付着させて腹膜を密封し、次いで窓の端の周りに接着剤を塗布して、皮膚が窓の上に再び成長するのを防ぐ縁を作る。膵臓に窓を挿入するには、マウスを右側方褥瘡の位置に置き、左脇腹に切開をしてから、前述のように腹膜の一部を除去します。滅菌生理食塩水で浸した滅菌綿棒を用いて、脾臓を優しく引っ張り、膵臓を視覚化した。
湿らせた綿棒で膵臓の位置を変えて、切開部を通してより多くの表面積が見えるようにします。膵臓にアクセスしたら、前に説明したように、イメージングウィンドウを目的の領域に挿入して密封します。乳腺にアクセスするには、マウスを仰臥位に置き、滅菌はさみと鉗子を使用して鼠径乳首の1つに10ミリメートルの切開内側を作ります。
乳腺の上の皮膚の0.5平方センチメートルの部分を取り除き、その後、付着を破壊するために2つの表面の間に滅菌はさみを広げることによって乳腺を皮膚から静かに分離する。31ゲージシリンジを使用して、画像化する領域の縁の周りの乳腺の表面に少量の外科用接着剤を塗布する。接着剤が乾くまで、窓を乳腺にしっかりと押し付けます。
窓の縁を皮膚の下に折り畳んだ後、皮膚の下にある窓の端に少量の手術用接着剤を付着させ、鉗子で皮膚を押し下げて皮膚を窓に固定する。窓の端の周りに接着剤を塗布して、皮膚が窓の上に再び成長するのを防ぐ縁を作ります。イメージングセッションを開始する前に、70%エタノールに浸した綿棒で窓を優しく拭いて、残留破片から窓をきれいにしてください。
水浸漬レンズを利用する場合は、超音波ゲルを窓に塗布し、気泡を避けてください。イメージングを開始するには、眼を通してグリッドの位置を見つけて焦点を合わせます。次に、グリッドの下部をゼロに設定して、おおよその組織イメージング深度を決定します。
この情報は、後続のイメージングセッションで対応するZ平面を見つけるのに役立ちます。複数のイメージングセッションで同じ位置を特定するには、グリッド上の正方形を参照点として使用します。イメージングセッション中に、グリッドの向きと、グリッド内でイメージングされた各視野の位置を書き留めます。
グリッドを使用して、イメージングセッションの成功時に特定のグリッド領域およびイメージングフィールドに戻ることができます。各撮影セッションに続いて、70%エタノールに浸した綿棒で窓を優しく拭いて、残留レンズ浸漬媒体および破片を除去する。シリコーンウィンドウは、時間の経過とともに動的な免疫細胞浸潤を捕捉することを可能にする。
代表的な分析は、2日目および4日目におけるリモデリング乳腺組織内の好中球浸潤を示す。シリコーンウィンドウは、ウィンドウ挿入後数週間にわたって複数の時点で腫瘍を視覚化することを可能にする。200ミリグラムのPDMSで鋳造された窓は、150ミリグラムの窓鋳造よりも有意に大きな靭性を示したため、一般に外科的移植に優れています。
注目すべきは、PDMS窓は標準的なガラスほど剛性がなく、ガラス窓のヤング率がPDMSよりも有意に高いことに表された。異なる器官への窓の挿入は、ほとんどのマウスが時間の経過とともに体重を増やし続けたため、忍容性が良好であった。この手順を試みるときに覚えておくべき最も重要なことは、接着剤を使用して窓を完全に密閉することです。
これにより、感染、組織の乾燥、および窓の変位を防ぐことができます。この手順に続いて、同所性注射をシリコーンウィンドウを介して行うことができ、研究者は細胞増殖、細胞間相互作用、治療効果など、さまざまなトピックを研究することができます。
