カンディダは、免疫不全宿主における真菌感染の最も一般的な原因である。マトリックスのためにバイオフィルムを完全に浸潤させる治療薬の失敗は、バイオフィルムが従来の治療法に抵抗する理由の1つです。私たちのプロトコルは、赤い光を使用して光療法がカンディダ・アルビカンスのバイオフィルムの成長と配置をどのように妨げるかを評価します。
この研究で使用された菌株は細胞外マトリックスを特徴としており、軽いデバイスは他のプランクトン微生物懸濁液およびバイオフィルムにうまく適用されているため、適用される方法は十分に確立されている。この装置の最大の利点は、治療時間の短縮であり、臨床用途に対してより目に見えるようにします。カンディダ・アルビカンスを培養する際には抗体を獲得できることに注意してください。
したがって、7日以上前のコロニーを使用しないこと、摂氏4度でプレートを開始しないこと、および既存のプレートから細胞を再ストリークしないことが重要です。同様に、株は、一晩の成長の18時間前に使用する必要があります。分光光度計を初めて用いる場合は、まず、単位数でコロニーファームを得て、光学密度値に相関させることが重要である。
したがって、実験は、1ミリリットル当たり10〜7個の細胞の初期細胞濃度での成長期の中間を使用して開始されます。この細胞濃度は、最も依存性および安定物質バイオフィルムを提供することが示されている。まず、65グラムのSDAを中断し、クロラムフェニコール1リットル当たり50ミリグラムをビーカーに1,000ミリリットルの蒸留水で加えます。
ビーカーをヒーターの上に置き、沸騰させ、媒体を完全に溶解させる。その後、ガラス瓶にメディアを転送します。キャップをボトルの上に置きますが、ボトルが通気できるように完全にねじ込まないでください。
ボトルをオートクレーブに入れ、溶液を15 PSI、摂氏121度で30分間殺菌します。約45°Cに溶液を冷却します。使い捨ての無菌ピペットを使用してよく混ぜ、20ミリリットルのSDAを無菌ペトリプレートにピペットします。
YNB培地を調製するには、100ミリモルグルコースを補充し、6.7グラムのYNBと18グラムのデキストロースをビーカーに1,000ミリリットルの超純水に混ぜる。ビーカーに攪拌バーを置き、攪拌プレートにビーカーを置いて混ぜます。0.22マイクロメートル真空フィルターシステムを介して媒体をフィルタリングして滅菌します。
10.4グラムのRPMI-1640と34グラムのMOPSを、1,000ミリリットルの超純水に混合してRPMI培地を調製します。熱を入れずに撹拌機に混ぜ、通常の水酸化ナトリウムを1つ加えてPHを7に調整します。0.22マイクロメートル真空フィルターシステムを使用して培地を殺菌します。
まず、微生物カンディダ・アルビカンSN425を周囲温度で解凍する。SDAを含む以前に調製されたペトリ皿上の停止培養の種子10マイクロリットルは、クロラムフェニコールを補った。ペトリ料理を摂氏37度で48時間加えてインキュベートします。
プレイノキュラムのために殺菌潤滑油を使用して、ペトリ皿からカンジダ・アルビカンの10コロニーを選び、グルコースを補った10ミリリットルのYNB培地を含む遠心分離管に入れる。チューブを摂氏37度で16時間好気的にインキュベートします。次に、このスターター培養液を新鮮なYNB培地に添加して接種物を調製し、グルコースを添加し、希釈のために1〜10の割合で調製する。
分光光度計を使用して、540ナノメートルでの初期ODを測定します。イノキュラムを摂氏37度で8時間好気的にインキュベートし、540ナノメートルで最終ODを測定する。初期 OD から最終 OD を引き、接種の OD が中間ログ成長フェーズにあるかどうかを確認します。
1ミリリットル当たり7個の細胞に10個の接種物を得るために、5分間5分間、500回G.次亜塩素酸ナトリウムを含むビーカーに上澄みを注ぎ、新鮮なYNBを加えて接種液を前の体積の半分に濃縮する。24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルに接種物の1ミリリットルを追加します。ウェルの底に細胞接着を可能にするために90分間摂氏37度で好気的にインキュベート。
正のコントロールバイオフィルムの場合は、1ミリリットルの0.12%クロルヘキシジンで1分間バイオフィルムを治療します。陰性対照のために、1ミリリットルの無菌、0.89%の塩化ナトリウムでバイオフィルムを1分間扱います。続いて、ウェルを2回、それぞれ1分間、無着着地0.89%塩化ナトリウム1ミリリットルで洗浄し、非接着細胞を除去する。
次に、コヒーレントでない赤色のライトを点灯し、パワーメーターを使用して光の電力密度を測定します。1 平方センチメートルあたり 87.6 ジュールのエネルギー密度要件に基づいて、露出時間を決定します。プレートを赤い光の下に置きます。
サンプルの温めを避けるために、光源とバイオフィルムの距離を5ミリリットルに保ちます。1分間の露出後、殺菌したRPMI培地を1ミリリットルずつ各ウェルに加え、プレートを一晩で摂氏37度でインキュベートします。午前中には、同じ洗浄、軽い治療、陽性および陰性の対照処理、およびRPMI培地で6時間のインキュベーションを繰り返します。
再び、バイオフィルムを2回洗浄し、赤色光にさらし、正および陰性のコントロール治療を行います。ウェル内の溶液を吸引し、RPMI培地を加えます。48時間のバイオフィルム開発を達成するまで、インキュベーション、洗浄、光処理、および正および陰性対照治療を繰り返す。
処理を開始するには、培地を廃棄し、滅菌の1ミリリットル、0.89%の塩化ナトリウムをウェルに加え、ピペットチップを使用して井戸からバイオフィルムを傷つけます。除去したバイオフィルムを滅菌チューブに移します。もう1ミリリットルの無菌、0.89%塩化ナトリウムを井戸に加えます。
もう一度傷つけ、同じチューブにサスペンションを追加し、合計容量は2ミリリットルです。バイオフィルム懸濁液を1分間激しく渦液する。CFU分析では、バイオフィルム懸濁液から0.1ミリリットルのアリコートを、希釈ごとに0.89%の塩化ナトリウム溶液の900マイクロリットルを含むマイクロ遠心管に移します。
バイオフィルム溶液を10からネガティブ溶液、10~ネガティブ4に、生理食塩水で希釈する。SDAプレートに希釈した各希釈液の種子50マイクロリットル、および48時間摂氏37度でプレートをインキュベートする。コロニーを数え、式を適用します。
乾燥重量分析のために、最初の重量を量り、マイクロ遠心分離管を標識する。バイオフィルム懸濁液0.1ミリリットルと絶対エタノール1ミリリットルをチューブに加え、マイナス20°Cで18時間保存します。次いで、遠心分離機を10,000回G10分間行う。
上清を捨て、デシケータにチューブを入れ、サンプルを1週間乾燥させます。マイクロ遠心管を再度秤量し、その減算を行ってバイオマス重量を求める。本実験では、カンジダ・アルビカンスバイオフィルムに対して1分間赤い光で日当処理を行った後、CFUを還元し、塩化ナトリウムで処理した陰性対照と比較した。
カンギダ・アルビカンスバイオフィルムのバイオマスの結果は毎日の処理後に、赤色光処理群が陽性対照群で観察されたものと同様の還元量を示し、クロルヘキシジンで処理した。2つのグループはまた、互いに統計的な類似性を示した。両者ともバイオマスの減少を示したが、塩化ナトリウムで処理された陰性対照と比較した。
可溶性および不溶性EPSのカンジダ・アルビカンスの劣った量は、陽性対照において観察された、陰性対照と比較した。統計的に有意ではないが、赤い光の日当適用はEPS可溶性およびEPS不溶性の量を数値的に減少させた。負の対照と赤色光処理群は、統計的類似性を示した。
光の電力密度を測定し、処理を開始する前にパワーメーターを使用して、適用の正確な期間を決定する。このステップでは、エネルギー密度は常に 87.6 ジュール/センチメートル平方になります。前述の数式を使用します。
測定は、プレートのボトルに光から同じ、5ミリメートルを使用して行われます。光療法と抗真菌薬の関連を調べ、赤い光による前処理、続いて薬物適用がバイオフィルムへの薬物浸透を改善しているかどうかを確認することができる。1日2回の治療のために、私たちは、赤信号処理後の生存率、乾燥重量、および細胞外多糖量に関する回答を提供する、簡単で再現可能なバイオフィルムモデルを提供する、実験室のプロトコルを適応させました。
このプロトコルは一般的であり、薬物、他のライト、または光と薬物の組み合わせを含む赤色光に加えて、他の治療法のテストに使用できます。微生物の操作には、安全メガネ、ボタンラボコート、ニトロ手袋などの特別な装置が必要です。
