Candida est la cause la plus fréquente d’infection fongique disséminée chez les hôtes immunocompromisés. L’incapacité des agents thérapeutiques à infiltrer complètement le biofilm en raison de la matrice est l’une des raisons pour lesquelles les biofilms résistent aux thérapies traditionnelles. Notre protocole évalue comment la photothérapie, à l’aide de la lumière rouge, interfère avec la croissance et l’arrangement des biofilms Candida albicans.
Les méthodes appliquées sont bien établies, puisque la souche utilisée dans cette étude a eu sa matrice extracellulaire caractérisée et le dispositif léger a été appliqué avec succès à d’autres suspensions planctoniques de micro-organisme et biofilms. Le plus grand avantage de cet appareil est la réduction du temps de traitement, ce qui le rend plus visible pour les applications cliniques. Lors de la culture Candida albicans être conscient que les anticorps peuvent être acquis.
Par conséquent, il est important de ne pas utiliser des colonies qui ont plus de sept jours, de ne pas commencer les plaques à quatre degrés Celsius, et de ne pas re-stries cellules à partir de plaques existantes. De même, une souche doit être utilisée avant 18 heures de croissance pendant la nuit. Lors de l’utilisation d’un spectrophotomètre pour la première fois, il est important d’obtenir d’abord la ferme de la colonie dans le nombre d’unités, pour corréler aux valeurs de densité optique.
Par conséquent, les expériences commenceront à utiliser le milieu de la phase de croissance dans la concentration cellulaire initiale de 10 à sept cellules par millilitre. Il a été démontré que cette concentration cellulaire fournit les biofilms de matière les plus dépendants et les plus stables. Pour commencer, suspendre 65 grammes de SDA, complétés par 50 milligrammes par litre de chloramphéniphénicol, dans 1000 millilitres d’eau distillée dans un bécher.
Déposer le bécher sur un radiateur pour faire bouillir, afin de dissoudre complètement le milieu. Ensuite, transférez les supports dans une bouteille en verre. Placez le bouchon sur la bouteille, mais ne le vissez pas complètement pour vous assurer que la bouteille est capable de se défouler.
Placez la bouteille dans un autoclave pour stériliser la solution à 15 PSI et 121 degrés Celsius pendant 30 minutes. Refroidir la solution à environ 45 degrés Celsius. Utilisez une pipette jetable et stérile, pour bien mélanger, et pipette 20 millilitres de SDA dans des plaques de Petri stériles.
Pour préparer ynb moyen, complété avec 100 millimolar glucose, mélanger 6,7 grammes de YNB et 18 grammes de dextrose à 1000 millilitres d’eau ultra pure dans un bécher. Placer un émoi dans le bécher et mettre le bécher sur une plaque à remuer pour mélanger. Filtrer le milieu à travers un système de filtre à vide de 0,22 micromètre pour stériliser.
Préparer rpmi moyen en mélangeant 10,4 grammes de RPMI-1640 et 34 grammes de MOPS, à 1000 millilitres d’eau ultra pure. Mélanger dans un agitateur sans chaleur et ajuster le PH à sept en ajoutant un hydroxyde de sodium normal. Stériliser le milieu à l’aide d’un système de filtre à vide de 0,22 micromètre.
Tout d’abord, décongeler le micro-organisme Candida albicans SN 425 à température ambiante. Graine 10 microlitres de la culture stop sur les plats Petri précédemment préparés contenant du SDA, complétés par du chloramphéniphénol. Incuber les boîtes de Pétri aérobiement à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.
Pour le pré-inoculum utiliser un lubrifiant stérilisé pour ramasser 10 colonies d’albicans Candida dans les boîtes de Petri et les placer dans un tube de centrifugeuse contenant 10 millilitres de milieu YNB, complétée par du glucose. Incuber le tube aérobiement à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Ensuite, préparez les inoculums en ajoutant cette culture de démarrage dans le milieu frais de YNB, complété avec le glucose, dans une proportion à 10 pour la dilution.
Utilisez le spectrophotomètre pour mesurer l’OD initial à 540 nanomètres. Incuber les inoculums aérobiement à 37 degrés Celsius pendant huit heures, et mesurer l’OD final à 540 nanomètres. Soustrayez l’OD final de l’OD initial pour vérifier si l’OD des inoculums est sur la phase de croissance de mi-journal.
Pour obtenir un inoculum avec 10 à sept cellules par millilitre, centrifugez l’inoculum pendant cinq minutes à 5 500 fois G.Versez le supernatant dans un bécher contenant de l’hypochlorite de sodium et ajoutez du YNB frais pour concentrer l’inoculum à la moitié du volume précédent. Ajouter un millilitre de l’inoculum à chaque puits d’une plaque de polystyrène de 24 puits. Incuber aérobiement à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes pour permettre l’adhérence cellulaire au fond des puits.
Traitez les biofilms pendant une minute avec un millilitre de chlorhexidine de 0,12 % pour les biofilms de contrôle positif. Pour le contrôle négatif, traiter les biofilms pendant une minute avec un millilitre de chlorure stérile de sodium à 0,89 %. Par la suite, lavez les puits deux fois, une minute chacun, avec un millilitre de chlorure stérile de sodium de 0,89 % pour éliminer les cellules non adhérentes.
Allumez ensuite une lumière rouge non cohérente et utilisez un compteur de puissance pour mesurer la densité de puissance de la lumière. Déterminer le temps d’exposition en fonction de l’exigence de densité énergétique de 87,6 joules par centimètre carré. Placez la plaque sous le feu rouge.
Gardez la distance entre la source de lumière et le biofilm à cinq millilitres pour éviter de réchauffer l’échantillon. Après une exposition d’une minute, ajouter un millilitre du milieu rpmi stérilisé à chaque puits, et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le matin, répétez le même lavage, traitement léger, traitements de contrôle positifs et négatifs, et incubation pendant six heures avec le milieu rpmi.
Encore une fois, lavez les biofilms deux fois, exposez-les à la lumière rouge et effectuez des traitements de contrôle positifs et négatifs. Aspirer la solution dans les puits et ajouter rpmi moyen. Répétez l’incubation, le lavage, le traitement léger et les traitements de contrôle positifs et négatifs, jusqu’à ce qu’ils atteignent 48 heures de développement de biofilms.
Pour commencer le traitement, jetez le milieu et ajoutez un millilitre de chlorure stérile et 0,89 % de sodium au puits, et utilisez une pointe de pipette pour rayer le biofilm du puits. Transférer le biofilm retiré dans un tube stérile. Ajouter un millilitre de chlorure stérile de 0,89 % de sodium au puits.
Grattez-le à nouveau et ajoutez la suspension au même tube, pour un volume total de 2 millilitres. Vortex vigoureusement la suspension du biofilm pendant une minute. Pour l’analyse CFU, transférer un aliquot de 0,1 millilitres de la suspension du biofilm à un tube de micro centrifugeuse contenant 900 microlitres de solution de chlorure de sodium à 0,89 % pour chaque dilution.
Diluer la solution biofilm de 10 à la solution négative, à 10 à quatre négative, dans la solution saline. Ensemencer 50 microlitres de chaque dilution aux plaques SDA, et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Comptez les colonies et appliquez la formule.
Pour l’analyse du poids sec, pesez et étiquetez d’abord les tubes de micro centrifugeuse. Ajouter 0,1 millilitres de suspension biofilm et un millilitre d’éthanol absolu dans les tubes, et les stocker à 20 degrés Celsius négatifs pendant 18 heures. Ensuite, centrifugez-le 10 000 fois G pendant 10 minutes.
Jeter le supernatant et placer les tubes dans un dessiccateur pour sécher les échantillons pendant une semaine. Pesez à nouveau les tubes de micro centrifugeuse et faites la soustraction pour obtenir le poids de la biomasse. Dans cette expérience, après des traitements par jour avec la lumière rouge pendant une minute aux biofilms candida albicans, le CFU a été réduit, comparé au contrôle négatif traité avec le chlorure de sodium.
Les résultats de la biomasse des biofilms candida albicans après des traitements quotidiens, montrent que le groupe traité à la lumière rouge présentait une réduction similaire de la biomasse à celle observée dans le groupe témoin positif, traité avec de la chlorhexidine. Les deux groupes ont également montré une similitude statistique l’un avec l’autre. Bien qu’ils ont tous deux montré une réduction de la biomasse, par rapport au contrôle négatif traité avec du chlorure de sodium.
Des quantités inférieures d’EPS soluble et insoluble de Candida albicans, ont été observées dans le contrôle positif, comparé au contrôle négatif. Même s’il n’est pas statistiquement significatif, l’application par jour de la lumière rouge a diminué numériquement les quantités d’EPS solubles et d’EPS insolubles. Le contrôle négatif et le groupe traité de lumière rouge, ont montré la similitude statistique.
Mesure de la densité de puissance de la lumière, à l’aide d’un compteur de puissance avant de commencer le traitement pour déterminer les périodes exactes d’application. Les marches assurent que la densité énergétique sera toujours de 87,6 joules par centimètre au carré. Utilisez la formule précédemment citée.
La mesure est faite en utilisant la même chose de la lumière à la bouteille des plaques, cinq millimètres. Une association entre la photothérapie et les médicaments antifongiques peut être étudiée pour vérifier si le prétraitement avec la lumière rouge, suivi de l’application de médicaments, améliore la pénétration des médicaments dans le biofilm. Pour le traitement deux fois par jour, nous avons adapté les protocoles de notre laboratoire, fournissant un modèle de biofilm facile et reproductible, qui fournit des réponses concernant la viabilité, le poids sec et les quantités extracellulaires de polysaccharide après traitement à la lumière rouge.
Le protocole est générique et peut être utilisé pour tester d’autres thérapies, en plus de la lumière rouge, y compris les médicaments, d’autres lumières, ou la combinaison de la lumière et des médicaments. Travailler avec des micro-organismes nécessite un équipement spécial, comme des lunettes de sécurité, un manteau de laboratoire à boutons et des gants nitro.
