Candida ist die häufigste Ursache für verbreitete Pilzinfektionen bei immungeschwächten Wirten. Das Versagen von therapeutischen Wirkstoffen, Biofilm aufgrund der Matrix vollständig zu infiltrieren, ist ein Grund, warum Biofilme traditionellen Therapien widerstehen. Unser Protokoll bewertet, wie die Phototherapie mit Rotem Licht das Wachstum und die Anordnung von Candida albicans Biofilmen beeinträchtigt.
Die angewandten Methoden sind gut etabliert, da der in dieser Studie verwendete Stamm seine extrazelluläre Matrix charakterisiert hatte und das Lichtgerät erfolgreich auf andere planktonische Mikroorganismensuspensionen und Biofilme angewendet wurde. Der größte Vorteil dieses Gerätes ist die Verkürzung der Behandlungszeit, die es für klinische Anwendungen sichtbarer macht. Bei der Kultivierung candida albicans beachten Sie, dass Antikörper erworben werden können.
Daher ist es wichtig, keine Kolonien zu verwenden, die mehr als sieben Tage alt sind, nicht Platten bei vier Grad Celsius zu starten und zellen nicht von vorhandenen Platten neu zu streichen. Ebenso sollte eine Sorte vor 18 Stunden des Tageswachstums verwendet werden. Bei der ersten Verwendung eines Spektralphotometers ist es wichtig, zuerst Koloniefarmen in Einheitenzählungen zu erhalten, um mit optischen Dichtewerten korrelieren zu können.
Daher werden Experimente beginnen, die Mitte der Wachstumsphase in der anfänglichen Zellkonzentration von 10 bis sieben Zellen pro Milliliter zu verwenden. Diese Zellkonzentration liefert nachweislich die abhängigsten und stabilsten Materie-Biofilme. Um zu beginnen, suspendieren 65 Gramm SDA, ergänzt mit 50 Milligramm pro Liter Chloramphenicol, in 1 000 Milliliter destilliertes Wasser in einem Becher.
Legen Sie das Becherglas auf eine Heizung zum Kochen, um das Medium vollständig aufzulösen. Dann übertragen Sie die Medien in eine Glasflasche. Legen Sie die Kappe auf die Flasche, aber schrauben Sie sie nicht vollständig herunter, um sicherzustellen, dass die Flasche entlüftet werden kann.
Legen Sie die Flasche in einen Autoklaven, um die Lösung bei 15 PSI und 121 Grad Celsius für 30 Minuten zu sterilisieren. Kühlen Sie die Lösung auf etwa 45 Grad Celsius. Verwenden Sie eine Einweg-, sterile Pipette, um gut zu mischen, und Pipette 20 Milliliter SDA in sterile Petriplatten.
Um YNB Medium vorzubereiten, ergänzt mit 100 Millimolar Glukose, mischen 6,7 Gramm YNB und 18 Gramm Dextrose zu 1.000 Milliliter ultrareinem Wasser in einem Becher. Legen Sie eine Rührstange in den Becher und legen Sie den Becher auf eine Rührplatte zu mischen. Filtern Sie das Medium durch ein 0,22 Mikrometer Vakuumfiltersystem, um es zu sterilisieren.
Bereiten Sie RPMI Medium durch Mischen von 10,4 Gramm RPMI-1640 und 34 Gramm MOPS, um 1.000 Milliliter ultrareines Wasser. Mischen Sie einen Rührer ohne Hitze und stellen Sie den PH auf sieben ein, indem Sie ein normales Natriumhydroxid hinzufügen. Sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 Mikrometer Vakuumfiltersystem.
Zuerst tauen Sie den Mikroorganismus Candida albicans SN 425 bei Umgebungstemperatur auf. Samen 10 Mikroliter der Stop-Kultur auf zuvor zubereiteten Petrischalen mit SDA, ergänzt mit Chloramphenicol. Die Petri-Gerichte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius abevierisch bebrüten.
Für das Pre-Inoculum verwenden Sie einen sterilisierten Schmierstoff, um 10 Kolonien von Candida Albicans aus den Petrischalen zu pflücken und sie in ein Zentrifugenrohr mit 10 Milliliter NYNB-Medium zu legen, ergänzt mit Glukose. Inkubieren Sie die Röhre 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Dann bereiten Sie die Inokulums, indem Sie diese Starterkultur in frische SYNB Medium, ergänzt mit Glukose, in einem ein bis zehn Anteil für Verdünnung.
Verwenden Sie das Spektralphotometer, um die ursprüngliche OD bei 540 Nanometern zu messen. Inkubieren Sie die Inokulume acht Stunden lang abebisstehend bei 37 Grad Celsius und messen Sie die endgültige OD bei 540 Nanometern. Subtrahieren Sie die endgültige OD von der ursprünglichen OD, um zu überprüfen, ob sich die OD der Inoculums in der mittleren Wachstumsphase befinden.
Um ein Inokulum mit 10 bis sieben Zellen pro Milliliter zu erhalten, zentrifugieren Sie das Inokulum für fünf Minuten bei 5, 500 mal G.Pour den Überstand in ein Becherglas mit Natriumhypochlorit und fügen Sie frische sYNB, um das Inokulum auf die Hälfte des vorherigen Volumens zu konzentrieren. Fügen Sie einen Milliliter des Inokulums zu jedem Brunnen einer 24 Brunnen-Polystyrolplatte hinzu. Aerobic bei 37 Grad Celsius 90 Minuten lang bebrüten, um eine Zellhaftung am Boden der Brunnen zu ermöglichen.
Behandeln Sie die Biofilme eine Minute lang mit einem Milliliter 0,12% Chlorhexidin für die Positivkontrollbiofilme. Für die Negativkontrolle die Biofilme eine Minute lang mit einem Milliliter sterilem, 0,89%Natriumchlorid behandeln. Anschließend die Brunnen zweimal, jeweils eine Minute, mit einem Milliliter sterilem 0,89%Natriumchlorid waschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
Schalten Sie dann ein nicht kohärentes rotes Licht ein und verwenden Sie einen Leistungsmesser, um die Leistungsdichte des Lichts zu messen. Bestimmen Sie die Belichtungszeit basierend auf dem Energiedichtebedarf von 87,6 Joule pro Quadratzentimeter. Legen Sie die Platte unter das rote Licht.
Halten Sie den Abstand zwischen der Lichtquelle und dem Biofilm auf fünf Milliliter, um eine Erwärmung der Probe zu vermeiden. Nach der Exposition für eine Minute, fügen Sie einen Milliliter des sterilisierten RPMI Medium zu jedem Brunnen, und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am Morgen wiederholen Sie die gleiche Wasch-, Lichtbehandlung, positive und negative Kontrollbehandlungen und inkubation für sechs Stunden mit RPMI Medium.
Waschen Sie die Biofilme erneut zweimal, setzen Sie sie rotem Licht aus und führen Sie positive und negative Kontrollbehandlungen durch. Aspirieren Sie die Lösung in den Brunnen und fügen Sie RPMI Medium. Wiederholen Sie die Inkubation, waschen, leichte Behandlung, und positive und negative Kontrolle Behandlungen, bis zu erreichen 48 Stunden Biofilmentwicklung.
Um mit der Verarbeitung zu beginnen, entsorgen Sie das Medium und fügen Sie einen Milliliter steriles, 0,89%Natriumchlorid in den Brunnen, und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um den Biofilm aus dem Brunnen zu kratzen. Den entfernten Biofilm in ein steriles Rohr geben. Fügen Sie einen weiteren Milliliter steril, 0,89%Natriumchlorid in den Brunnen.
Kratzen Sie es erneut und fügen Sie die Suspension auf das gleiche Rohr, für ein Gesamtvolumen von 2 Milliliter. Die Biofilmsuspension für eine Minute kräftig wirbeln. Für die KBE-Analyse einen Aliquot von 0,1 Millilitern aus der Biofilmsuspension in ein Mikrozentrifugenrohr mit 900 Mikrolitern 0,89% Natriumchloridlösung für jede Verdünnung übertragen.
Verdünnen Sie die Biofilmlösung von 10 auf die negative, auf 10 auf die negative vier, in Salinelösung. Säen Sie 50 Mikroliter jeder Verdünnung zu SDA-Platten, und bebrüten die Platten bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Zählen Sie die Kolonien und wenden Sie die Formel an.
Für die Trockengewichtsanalyse wägen und beschriften Sie zunächst Mikrozentrifugenrohre. 0,1 Milliliter der Biofilmsuspension und einen Milliliter absolutes Ethanol in die Schläuche geben und 18 Stunden bei minus 20 Grad Celsius lagern. Dann zentrifugieren Sie es 10.000 mal G für 10 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie die Rohre in einen Trockenbau, um die Proben eine Woche lang zu trocknen. Wiegen Sie die Mikrozentrifugenrohre erneut und subtraktion, um das Biomassegewicht zu erhalten. In diesem Experiment wurde die KBE nach einer Minute lang mit rotem Licht auf Candida albicans Biofilme reduziert, verglichen mit der mit Natriumchlorid behandelten Negativkontrolle.
Die Ergebnisse der Biomasse von Candida albicans Biofilme nach täglichen Behandlungen, zeigen die Rotlicht behandelt Gruppe präsentiert eine ähnliche Reduktion der Biomasse wie in der positiven Kontrollgruppe beobachtet, mit Chlorhexidin behandelt. Die beiden Gruppen zeigten auch statistische Ähnlichkeiten untereinander. Während sie beide zeigten Reduktion der Biomasse, im Vergleich zu der negativen Kontrolle mit Natriumchlorid behandelt.
Im Vergleich zur Negativkontrolle wurden geringere Mengen an Candida albicans löslichem und unlöslichem EPS in positiver Kontrolle beobachtet. Obwohl nicht statistisch signifikant, verringerte die Pro-Diem-Anwendung von rotem Licht numerisch die Mengen an EPS löslich und EPS unlöslich. Die negative Kontrolle und die rotlichtbehandelte Gruppe zeigten statistische Ähnlichkeiten.
Messung der Leistungsdichte des Lichts unter Verwendung eines Leistungsmessers vor Beginn der Behandlung, um die genauen Anwendungszeiträume zu bestimmen. Die Schritte stellen sicher, dass die Energiedichte immer 87,6 Joule pro Zentimeter quadratisch beträgt. Verwenden Sie die zuvor zitierte Formel.
Die Messung erfolgt mit dem gleichen von der Licht bis zur Flasche der Platten, fünf Millimeter. Ein Zusammenhang zwischen Phototherapie und Antimykotika kann untersucht werden, um zu überprüfen, ob die Vorbehandlung mit rotem Licht, gefolgt von der Anwendung von Medikamenten, die Durchdringung von Medikamenten in den Biofilm verbessert. Für die zweimal tägliche Behandlung haben wir die Protokolle unseres Labors angepasst und ein einfaches und reproduzierbares Biofilmmodell bereitgestellt, das Antworten auf Lebensfähigkeit, Trockengewicht und extrazelluläre Polysaccharidmengen nach der Rotlichtbehandlung liefert.
Das Protokoll ist generisch und kann für die Prüfung anderer Therapien verwendet werden, zusätzlich zu Rotlicht, einschließlich Medikamente, andere Lichter, oder die Kombination von Licht und Drogen. Die Arbeit mit Mikroorganismen erfordert spezielle Ausrüstung, wie Schutzbrillen, Knopflabormäntel und Nitrohandschuhe.
