腸内ウイルスは、地下水、静水、河川、河川、r水など、さまざまな水生貯水池で主に見られます。彼らは健康上のリスクに関連付けられており、人間の感染症の責任があります。腸内ウイルスは一般的に胃腸炎を引き起こし、主に便経口経路を介して伝染する。
他の水媒介性疾患は、A型肝炎ウイルスおよびE型肝炎ウイルスによって急性肝炎を引き起こし、特に妊婦のE型肝炎に関して有意な関連死亡率を有する。人道的文脈のために提案された水質を監視するための実際のプロトコルは、便汚染の指標として大腸菌などの細菌を維持するように設計されています。しかし、多くの活性化プロセスに対してより耐性のあるウイルスなどの他の微生物との相関関係は既に知られていません。
これまで、人道危機の場面でウイルスの検出を行うには、既存のプロトコルをその状況に適合させ、サンプルをウイルスの分子検出のための参照ラボに送り込んでいきました。公衆衛生上のリスクを軽減し、発生を防ぎ、人道的介入の効率を高めるために、ウイルス病原体とウイルス指標を検出する方法が必要です。ウイルス濃度、核酸抽出、ウイルス検出の3段階に分けられる10リットルの水サンプル中のウイルス検出方法を提案する。
これらのステップはすべて、現在当研究室で使用されている方法から適応されており、携帯用試薬や機器を使用して、電源や冷凍庫の依存物を生産することによって、視点で行うことができます。また、必要に応じて参照研究所に出荷するための核酸の安定性を保証する方法に防腐剤溶液が追加されました。我々が提案する方法はVirWaTestと呼ばれ、GenIULとインターモンオックスファムのコラボレーションで開発されました。
開始する前に、試薬および材料の調製のために試験するサンプルの数を考慮する必要があります。代表的な結果を得るために、各水サンプルの2つの複製を収集することをお勧めします。適切な量の材料が利用可能であれば、複数のサンプルを同時にテストすることができます。
試薬と材料は、方法が必要な場所に移動または出荷する前に準備し、梱包する必要があります。梱包する必要がある材料と小型機器のリストは、表1に記載されています。対応するISO法に従って、各水サンプルに添加するバクテリオファージMS2ストックをプロセス制御として用意します。
次に、10~10個のプラットホームユニットを含む懸濁液を10~10個のプラットホームユニットを10mLチューブに分配し、水を乾燥させます。水サンプルごとに1つのチューブが必要になります。さらに、採取したサンプルごとに10mの無菌蒸留水を含む1つのチューブを準備します。
フロキュラ付きスキムミルク液の場合は、スキムミルクを含むチューブ、海塩を含むジッパービニール袋、蒸留水を含むペットボトルを準備します。pH調整のために、クエン酸を含むチューブ、水酸化ナトリウムを含むチューブ、および25および50mLの蒸留水を含む2つのプラスチック容器を調製する。試験する水サンプルごとに、海塩とクエン酸をジッパービニール袋に加えてコンディショニング小袋を用意し、リシスバッファーと核酸保存剤を5mLチューブに加えて保存液を用意します。
最後に、4つの中和袋を準備し、4つのジッパービニール袋にパワー洗剤を加えます。抽出する水サンプルごとに、磁性粒子とエタノールを含む5つのmLチューブ1つと、500、600、および200マイクロリットルの洗浄バッファーをそれぞれ1、2、および3個の200マイクロリットルを含む3つの2mLチューブと、溶出バッファーを含む1つのチューブを調製する。ニューウェルサーモサイクラーを使用する場合、2つの異なる核酸抽出を各PCRアッセイで同時に分析することができます。
すべてのPCRアッセイに対して、分子生物学水を調製してください。プロトコルに記載された量と濃度に従って、各標的ウイルスに対して2つのプライマーと1つの証明を含む混合物を準備する。各ウイルスについて、示されたボリュームをチューブトレイの1〜8個に追加します。
ストリップを切り取り、2つのストリップに分割します。チューブ1〜5とチューブ6〜8。ウイルスごとに、10〜5、10〜7、および10〜9を含む空気乾燥DNA懸濁液および公知のコピーをチューブ6、7、および8に事前に作られた。
この濃度プロトコルは、低pHおよび高伝導性条件がスキムミルクタンパク質を駆動してウイルスが吸収するフロックに組織化する有機凝集の原理に基づいています。フロクが解決されると、簡単に収集することができます。蓋をした平底バケットに10リットルの水サンプルを集めます。
パイプから集める場合は、水を集める前に数秒間水を流してください。ペレットを視覚化するには、クリア バケットを使用することが重要です。直射日光から遠く離れた新鮮な場所で平らな空間を探す バケットサポートの下のバッテリーに接続された磁気スターラーを置き、各サポートに水サンプルを含むバケツを置きます。
クエン酸と水酸化ナトリウムを再考し、完全に溶解するまで振ります。500mLの蒸留水をスタンドアップバッグに注ぎ、磁気スターラーに袋を置きます。海塩小袋1個の内容物と1つのスキムミルクチューブの内容物を加え、中速で5分間かき混ぜます。
クエン酸と水酸化ナトリウムを使用して凝集スキムミルクのpHを3.4〜3.6の間のpHに調整します。磁気スターラーをオフにし、フロックが見えるようにします。懐中電灯は、フロックを視覚化するのに役立ちます。
かき混ぜる磁石を水に落とします。磁気攪拌機を最高速度で設定し、オンにします。プロセス制御チューブに10mLの蒸留水を加えます。
それを数回反転し、水に溶液を注ぎます。1つのサンプルコンディショニング小袋の内容物を水に注ぎ、5分間かき混ぜます。3.4と3.6の間にする必要があります水サンプルのpHを確認してください。
必要に応じて pH を調整します。100mLのフロキュラ付きスキムミルク溶液を加え、蓋でバケツを密封し、水を最低速度で8時間攪拌したままにします。8時間後、磁気スターラーをオフにし、フロクが少なくとも5時間余分に落ち着くようにします。
ピペットコントローラ、プラスチックチューブ、ピペットのカップルの使用に基づくシステムでは、バケット底部のフロクを邪魔しないように注意して、上清を捨てます。水位が攪拌磁石に達しそうだときは、プラスチックチューブを絞って水の流れを止め、バケツからピペットを離します。バケツを振ってフロックを再中断し、スタンドアップビニール袋に注ぎます。
フロクが1時間余分に落ち着くことを許可します。慎重にフロックを邪魔することを避けるピペットを使用して水上清を吸引します。ピペットを使用してフロクを吸引し、円錐形のチューブに移します。
サンプル濃縮物の最終容積を書き留め、保存液を含むチューブに1mLを移します。懸濁液は、現場で核酸抽出を行うために使用するか、またはさらなる分析のために参照実験室に出荷することができる。フロクを収集している間に廃棄された水は、処分前に処理する必要があります。
廃棄された水を含むバケツに中和剤の袋の内容を追加します。水を混ぜて、30分間静かにしておきます。その後、処理水を一般廃棄物として処分する。
磁性粒子は、磁性ピペットを使用してチューブ間を移動することができます。抽出を行う前に磁気ピペットの操作に慣れよ。抽出に必要な試薬を含むチューブをラックに並べ替えます。
すなわち、左から右へ:結合バッファー、洗浄バッファー、および溶出バッファー。使い捨てのプラスチックピペットを使用して、結合バッファーを含むチューブに濃縮サンプル 1 mL を移します。チューブを10回反転して、ソリューションを最適化します。
単独の軌道または手動で連続的に混合しながら、室温で10分間溶液をインキュベートします。磁気ピペットと3つの洗浄バッファーに再利用できるクリーンチップを使用して磁性粒子を収集し、洗浄バッファー1を含むチューブに磁性粒子を放出します。先端で溶液を30秒間軽く振って洗い、回収します。
バッファー 2 と 3 を洗浄する場合は、この洗浄手順を繰り返します。洗浄バッファー 3 に磁性粒子を集め、溶出バッファーを含むチューブに放出します。その後、チップを破棄します。
ソロ軌道を使用して連続的に混合しながら、室温で5分間溶液をインキュベートします。磁気ピペットの先端を任意のチップに交換し、溶出バッファーからすべての磁性粒子を収集します。パーティクルを取り付けた状態で、先端を廃棄します。
核酸は溶出バッファーに残り、さらなる分析または出荷のために保管する必要があります。ヒトアデノウイルスを検出するために準備された5チューブと3チューブストリップを使用してください。プロトコルに従って、チューブ1~5に水、PCRミックス、核酸外挿を加えます。
その後、6~8本のチューブに水とPCRミックスを加えます。両方のストリップをサーモサイクラーに入れ、適切なランを選択します。実行が完了したら、結果を収集し、取得したデータを分析します。
ウイルス検査が陰性になった場合にのみ、MS2検出を行う必要があります。MS2検出用に用意されたチューブストリップを使用し、PCRに適した熱プロファイルを選択します。VirWaTest磁気核酸抽出をQIAgenウイルスRNAと比較し、ヒトアデノウイルスおよびMS2でスパイクされた水サンプルを試験することによってそれを模倣した。
還元試験p値は、試験した両方のウイルスの抽出方法としてQiAgenよりもVirWaTestを使用して有意に高いウイルス回復を示す。ウイルス濃度の開発された方法は、中央アフリカ共和国バンギとエクアドルのペデルナレスにあるオックスファム洗浄チームの協力を得て現場で試験され、水サンプルを採取し、開発された濃縮方法を適用して濃縮し、核酸抽出とウイルス定量のためにバルセロナの研究室に送った。エクアドルでは、試験されたすべてのサンプルでヒトアデノウイルスが検出されたのに対し、バンギで採取して濃縮された5つのサンプルのうち1つがヒトアデノウイルスに陽性反応を示した。
開発された方法は、中央アフリカ共和国バンギのオックスファム・インターモンのウォッシュチームとエクアドルのペデルナレスの別のチームによって評価されたときに有用であることが証明されました。VirWaTest は早期警戒システムの一部である場合も、水の衛生に関与する組織によるアウトブレーク調査に使用される場合もあります。この装置は、人道危機の文脈におけるウイルス性疾患の事故を減らすことを目的として、水中のウイルス病原体の分析と水の安全性管理の改善を促進する。
