PDXは、癌実験前臨床試験に革命を起こしました。私たちは今、実験室で、患者で何が起こっているかを模倣することができます。そして今、私たちは抵抗を克服する方法と、長期的に、患者の生存を増やす方法に取り組むことができます。
手順を実証する場合は、ミンシャオになります。まず、以前に採取した黒色腫組織を無菌ペトリ皿に移す。手術用ハサミ、メスの刃、鉗子を使用して、まず、可能な限り正常な組織から正常な組織を除去する。
そして、腫瘍内の中央に位置する淡い白っぽい組織によって同定された壊死組織を除去する。その後、メスを使用して、最初の腫瘍チャンクを外科用マウス移植のためにほぼ等しい部分に細分化します。腫瘍組織が機械的解離に難しすぎる場合は、メスを使用して腫瘍塊をできるだけ細かくミンチしてスラリーを形成します。
カルシウムとマグネシウムイオンなしで冷たいハンクのバランス塩溶液と50ミリリットルのチューブにスラリーを移します。摂氏4度で4分間220倍gの遠心分離機。上清を除去した後、腫瘍組織の1グラムあたり10ミリリットルの温められた新鮮な消化培地でスラリーを再懸濁する。
チューブを摂氏37度の水浴に20分間入れ、5分ごとに使い捨てのピペットで激しく混ぜます。最大50ミリリットルのHBSSを使用してスラリーを洗い、220倍gで4°Cで4分間遠心分離し、上清を取り除きます。腫瘍組織1グラムにつき5ミリリットルの事前温めたTEGバッファーを加え、振って穏やかに再中断し、チューブを混合することなく2分間摂氏37度に置きます。
トリプシンをクエンクするには、摂氏4度で4分間、220倍gの冷たい染色培地と遠心分離機の少なくとも1つの等しい量を加えます。上清を除去した後、腫瘍組織の1グラムにつき10ミリリットルの染色培地を加え、上下にピペットを入れてペレットを再懸濁する。40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してそれをフィルターし、マウス注入のための単一の細胞懸濁液を得る。
外科的切除または外科的生検組織を移植するために、最初にNSGの腰から髪を6〜8週齢の麻酔マウスから剃り、毛のない約1.5センチメートルから3センチメートルの領域を残す。腫瘍チャンクを準備し、ペトリの腫瘍スラリーを個々のマウンドに分けて外科的移植を行う。メスの刃を使用して、マウスの背面の中央に約5ミリメートルの長さの切開を行います。
鉗子の1組で、オペレータの反対側の切開の側面の皮膚を上に生命。一方、はさみでは、小さなはさみ切りで筋膜を優しく切断して筋肉層から皮膚を分離し、腫瘍組織用のポケットを作ります。メスの刃を使用して1つの腫瘍チャックと腫瘍スラリー組織の1つの個々のマウンドを拾い、作成されたポケットに組織を穏やかに置きます。
次に、ポケット内の腫瘍組織マウンドに100マイクロリットルの人工細胞外マトリックスを加えます。2組の鉗子を使用して、両端の切開部を引き上げて、巻きエッジが近づくようにします。その後、1つまたは2つの巻きクリップを適用して傷を閉じます。
皮下に鎮痛薬のキログラムあたり1〜5ミリグラムを注入します。.治癒が完全に完了したら、約7日後に傷のクリップを取り外します。マウスを毎週1回監視して、触知可能な腫瘍がないか確認します。
腫瘍が所望の体積に達したら、手術鉗子を使用して安楽死させたマウスの腫瘍に隣接する皮膚を持ち上げ、湾曲したはさみを使用して水平切断を行う。鈍い分離技術を使用して、腫瘍の両側および腫瘍の上の皮膚を動員し、腫瘍を露出させる。はさみとメスの刃を使用して、腫瘍を鼻隠しから分離します。
腫瘍を切り取り、滅菌ペトリ皿に移します。腫瘍を小さく切り、腫瘍から壊死組織を取り除く。将来の移植のために腫瘍組織をバンクするには、2〜3個の小さな腫瘍片を取り、1ミリメートル未満の小片にミンチします。
すべてのひき肉組織を2ミリリットルの極低温下品に移す。1ミリリットルの凍結培地を加え、よく混ぜます。バイアルをドライアイスの事前冷却されたイソプロパノールベースの細胞凍結容器に入れ、容器をマイナス80°Cの冷凍庫に一晩保管し、バイアルを液体窒素貯蔵に移します。
下流アッセイの凍結組織をスナップするには、腫瘍組織片を極低温バイアルに入れ、極低温の下品を液体窒素に即座に入れ、バイアルをマイナス80°Cの冷凍庫に保管します。腫瘍組織の増殖の3つの異なる方法を比較した場合、酵素消化を用いた腫瘍細胞の単一細胞懸濁液が最も成功した。より急速な腫瘍増殖を可能にすることに加えて、1つの初期腫瘍を10〜20匹のマウスに拡大するのに十分であったのに対し、腫瘍チャックおよびスラリー法は5〜10匹のマウスにしか拡大できない。
黒色腫患者由来の異種移植片モデルは、多くの場合、治療中に患者が表示する薬物感受性を反映する。BRAF阻害剤に最初に反応したが、最終的に再発した黒色腫患者に由来する異種移植片は、BRAFタンパク質阻害に対する初期感受性を示し、MEKキナーゼ阻害剤を加えたが、腫瘍は最終的に再発した。これは、将来のPDX拡張、治療試験、および特性評価の成功を確実にするため、銀行業務用のPDX組織を準備する際に注意することが重要です。
PDX材料、単一細胞RNAシーケンシング、全エキソメシーケンシング、プロテオミクス特性解析により、私たちの研究室が治療抵抗性を解剖するために活用する多くの方法の一つです。PDX技術は、研究者がプラスチックで栽培された伝統的な癌モデルに比べてヒト患者の腫瘍生物学をよりよく再現する腫瘍細胞を使用して治療抵抗性を調査することを可能にする。この利点は、より予測的な洞察を可能にします。
研究者は常に注意を払い、人間の患者由来の腫瘍組織を取り扱う際にバイオセーフティレベル2つの予防措置を使用する必要があります。
