このプロトコルは、静脈奇形の組織病理学を再現する患者由来の異種移植片を作成するために使用することができる。これはさらに、私たちの前臨床治療試験を運ぶことが許されました。この技術は患者直接内皮細胞の成長および実験療法への応答の毎日の監視を可能にする速く、信頼できるNVivoシステムを提供する。
この方法は、他のタイプの血管またはリンパ管異常を調査するために容易に適応することができる。まず、細胞懸濁液を注射用に準備します。5ミリリットルのプレ温め 0.05%のトリプイン-EDTAを摂氏37度で2分間トリプシンします。
トリップインを中和し、EGMの5ミリリットルを追加し、150ミリリットルの円錐管に細胞を収集します。遠心分離機を5分間Gの400倍にし、上清を吸引し、細胞を3ミリリットルのEGMで再懸濁する。ヘモサイトメーターで細胞を数えます。
望ましい細胞数を持つ体積を新しい50ミリリットルの円錐形チューブにベンチャーし、遠心分離によって細胞を再びペレットにします。上清を吸引し、小容量を残して細胞ペレットを緩める。細胞ペレットを1回の注射につきBMEMの220マイクロリットルで再懸濁する。
泡を作らないように氷の上に細胞懸濁液を十分に混ぜます。BMEM細胞培養物を吸引し、プランジャーを引っ張って1ミリリットルのシリンジ開口部に混ぜる。26ゲージの無菌針を注射器にロックし、注射前に準備した注射器を氷の上に平らに保ちます。
マウスが適切に麻酔をしていることを確認した後、その胃の上に置き、70%エタノールで注射領域を消毒します。準備したシリンジをそっとロールし、落ち着いた細胞を再中断します。フレークは、注射器の端に気泡し、細胞懸濁液の少量を排出します。
注射部位で皮膚をつまんで、構造のようなテントを作ります。その後、皮膚のすぐ下に針を挿入し、針が筋肉組織への注入を防ぐためにピンチ皮膚を放出することによって皮膚の深さだけであることを確認します。針を保持し、慎重に慎重に細胞懸濁液の200マイクロリットルを注入し、小さな球状の塊を作成します。
細胞の懸濁液を筋肉に注入しないように注意してください。キャリパーで各プラグの長さと幅を測定します。解剖された異種移植片プラグを定規の横のまな板の上に合わせ、画像を撮って病変の総血管を記録します。
その後、室温で一晩10%ホルマリンに浸してプラグを固定します。解剖後、病変プラグは組織学的分析のために処理され、UEA-1がプラグ内のヒト由来の内皮細胞を検出するために染色される。重なりを避けるために、病変部内のX面パターンで20 X倍率で明視野顕微鏡で病変部あたり5つのHPF画像を取る。
撮影した画像にスケールバーを必ず含めます。画像のHPF画像を開き、スケールバーのピクセルを調整J.To、直線ツールを使用してスケールバーを通過します。次に、[分析]と[スケールを設定]をクリックして、測定されたピクセルをミリメートルに変換します。
次に、[セットの計測値を解析]をクリックし、領域を選択してオーバーレイに追加します。分析を使用してHPFの合計フィールド面積を測定し、定量のためにこの測定を保存します。フリーハンド選択ツールを使用して、UEA-1陽性血管チャネルを手動で概説します。
[解析と測定] をクリックして、アウトライン領域を数値化します。HPF内のすべての血管チャネルを測定します。各セクション内で取得した 5 つの HPF に対してこのプロセスを繰り返し、さらに分析するために値を Excel に転送します。
次に、原稿の方向に従って血管面積と血管密度の割合を計算します。このプロトコルを使用して、TIE2またはPIK3CAの多動性変異体内皮細胞を有する病変プラグは、注射後7〜9日以内に目に見えて血管化され、浸透する。病変プラグは、ヒトVM組織の組織病理学的特徴と、内皮細胞の薄い層によって整列された大きな血管チャネルが見えるのをよく似ている。
これらの血管構造は、典型的には、宿主マウス血管系を用いて機能的吻合を確認する赤血球を含む。UEA-1ヒト特異的レクチンを用いた免疫構造染色は、血管領域を裏打ちする細胞がマウス血管構造ではなくヒト移植細胞に由来することを確認する。この手順に従って、増殖またはアポトーシスのマーカーに対する病変セクションの追加染色を行い、実験的治療の特定の効果を分析することができる。
このセノミックモデルは、VM患者に対するいくつかの臨床試験で有効性を示しているmTOR阻害剤ラパマイシンのような静脈奇形の新しい治療法の前臨床試験に使用されています。
