O PDX revolucionou os estudos pré-clínicos experimentais do câncer. Agora podemos imitar, em laboratório, o que está acontecendo nos pacientes. E agora podemos trabalhar em como superar a resistência e como, a longo prazo, podemos aumentar a sobrevivência dos pacientes.
Demonstrando o procedimento será Min Xiao. Para começar, transfira tecido de melanoma previamente coletado para uma placa de Petri estéril. Trabalhando com tesoura cirúrgica, lâmina de bisturi e fórceps, primeiro remova o tecido normal o máximo possível.
E então remova o tecido necrosado identificado pelo tecido branco pálido localizado centralmente dentro do tumor. Em seguida, use um bisturi para subdividir um pedaço inicial do tumor em pedaços aproximadamente iguais para implantação cirúrgica de camundongos. Se o tecido tumoral for muito duro para dissociação mecânica, use um bisturi para picar os pedaços tumorais o mais finamente possível para formar um chorume.
Transfira o chorume para um tubo de 50 mililitros com solução fria de sal balanceado hank sem íons de cálcio e magnésio. Centrifugar a 220 vezes g por quatro minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o supernascido, suspenda o chorume em 10 mililitros de mídia de digestão fresca e aquecida por um grama de tecido tumoral.
Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius por 20 minutos e misture vigorosamente a cada cinco minutos com uma pipeta descartável. Lave o chorume usando até 50 mililitros de HBSS, centrífuga a 220 vezes g por quatro minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, remova o sobrenante. Adicione cinco mililitros de tampão TEG pré-aquecido por um grama de tecido tumoral, agite para suspender suavemente e coloque o tubo a 37 graus Celsius por dois minutos, sem misturar.
Para saciar a trippsina, adicione pelo menos um volume igual de mídia de coloração fria e centrífuga a 220 vezes g por quatro minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o supernasce, adicione 10 mililitros de mídia de coloração por um grama de tecido tumoral, e suspenda a pelota por tubulação para cima e para baixo. Filtre-o através de um filtro de célula de 40 micrômetros para obter uma suspensão de uma única célula para injeção do mouse.
Para implantar excisão cirúrgica ou tecido biopsia cirúrgica, primeiro raspe os cabelos da parte inferior das costas do NSG de seis a oito semanas de camundongos anestesiados, deixando uma área de aproximadamente 1,5 centímetros a três centímetros sem cabelo. Prepare pedaços de tumor e divida o chorume tumor em um Petri em montes individuais para implantação cirúrgica. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão de aproximadamente cinco milímetros de comprimento no centro da parte de trás do mouse.
Com um par de fórceps, a vida até a pele ao lado da incisão em frente ao operador. Com uma tesoura na outra mão, separe a pele da camada muscular cortando suavemente a membrana fascial com pequenos cortes de tesoura, criando assim um bolso para o tecido tumoral. Use uma lâmina de bisturi para pegar um mandril tumoral, bem como um monte individual de tecido de chorume tumoral, e coloque suavemente o tecido no bolso criado.
Em seguida, adicione 100 microliters de matriz extracelular artificial no monte de tecido tumoral no bolso. Usando dois pares de fórceps, puxe a incisão em ambas as extremidades para que as bordas da ferida se aproximem. Em seguida, aplique um ou dois clipes de ferida para fechar a ferida.
Subcutâneamente injete de um a cinco miligramas por quilograma de analgésico. Quando a cura estiver completamente, após aproximadamente sete dias, remova os clipes da ferida. Monitore camundongos uma vez por semana para verificar se há tumores palpáveis.
Uma vez que os tumores atinjam o volume desejado, use fórceps cirúrgicos para levantar a pele adjacente ao tumor do rato eutanizado e fazer um corte horizontal usando uma tesoura curva. Use uma técnica de separação contundente para mobilizar a pele em ambos os lados do tumor e sobre o tumor, expondo o tumor. Use uma tesoura e uma lâmina de bisturi para separar o tumor da fáscia.
Corte o tumor e transfira para uma placa de Petri estéril. Corte o tumor em pequenos pedaços e remova tecido necrosado do tumor. Para bancar o tecido tumoral para implantação futura, pegue de dois a três pequenos pedaços tumorais e pique-os em pedaços menores que um por um milímetro.
Transfira todo o tecido picado para um vile criogênico de dois mililitros. Adicione um mililitro de mídia congelante e misture bem. Coloque os frascos em um recipiente de congelamento de células à base de isopropanol pré-resfriado em gelo seco, armazene o recipiente em um congelador de menos 80 graus Celsius durante a noite e, em seguida, transfira os frascos para o armazenamento de nitrogênio líquido.
Para quebrar o tecido congelado para ensaios a jusante, coloque os pedaços do tecido tumoral em um frasco criogênico, coloque o vil criogênico em nitrogênio líquido imediatamente, e armazene os frascos em um freezer de menos 80 graus Celsius. Quando três métodos diferentes de tecido tumoral em crescimento foram comparados, a suspensão de células únicas das células tumorais com o uso de digestão enzimática foi mais bem sucedida. Além de permitir um crescimento tumoral mais rápido, também foi suficiente para que um tumor inicial fosse expandido para 10 a 20 camundongos, enquanto o método de mandril e chorume tumoral só pode ser expandido para cinco a 10 camundongos.
Modelos de xenoenxerto derivados do paciente melanoma frequentemente refletem a sensibilidade medicamentosa que o paciente exibia quando estava na terapia. Um xenoenxerto derivado de um paciente de melanoma que inicialmente respondeu a um inibidor braf, mas finalmente teve recaída, também apresentou sensibilidade inicial à inibição da proteína BRAF, além do inibidor de quinase mek, mas os tumores finalmente tiveram recaídas. É fundamental tomar cuidado ao preparar o tecido PDX para o setor bancário, pois isso garantirá sucesso em futuras expansões do PDX, ensaios terapêuticos, bem como caracterização.
Com material PDX, sequenciamento de RNA de células únicas, sequenciamento de exome inteiro e caracterização proteômica, estão entre os muitos métodos que nosso laboratório aproveita para dissecar a resistência à terapia. A técnica PDX permite que os pesquisadores investiguem a resistência terapêutica usando células tumorais que melhor recapitulem a biologia tumoral em um paciente humano em relação aos modelos tradicionais de câncer cultivados em plástico. Essa vantagem permite insights mais preditivos.
Os pesquisadores devem sempre tomar cuidado e usar precauções de nível dois de biossegurança ao manusear tecido tumoral derivado de um paciente humano.
