クラス1ヒストンデアセチラーゼは、RpdAのような真菌感染症の治療のための潜在的な新しい標的として議論されている。しかし、さらなる特性評価には精製酵素活性が必要である。このプロトコルの主な利点は、1つのステップでの活動決定のためのネイティブTAPタグ付き複合体の迅速かつ十分な分離です。
このプロトコルに由来するHDAC複合体は、新規の真菌特異的デアクチラーゼ阻害剤の有効性スクリーニングに使用され得る。この方法は、TAPタグ付き真菌タンパク質の抽出と精製の基礎を提供し、他の酵素および株のプロトコルの確立の出発点として使用される可能性があります。この手順を開始するには、準備されたコニディアの各フラスコにCSSの10ミリリットルを追加します。
各フラスコを付属のスクリューキャップでしっかりと閉じ、激しく振ります。この後、残りのコニディアを完全に削り取るために無菌接種ループを使用してください。遠心分離管に置かれた40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してconidiaを渡し、1つのチューブにフラスコの5つから懸濁液を集めます。
次に、サンプルを遠心分離して、テキストプロトコルで概説されているようにサンプルを組み合わせて希釈します。フラスコの上に漏斗に最初の場所のチーズクロス。布を通して準備したミセリアをろ過し、脱イオン水で短時間洗います。
手の間とペーパータオルの間にチーズクロスを絞って、ミセリアからできるだけ多くの水分を取り除きます。この後、乾燥したミセリアを平らなシートとして、ネジ蓋付きのプラスチックビーカーに移します。液体窒素を使用して、ミセリアをフラッシュフリーズし、凍結乾燥前にマイナス80度で保存します。
その後、一晩菌体を凍結乾燥させます。翌日、ミセリアの温度が一定の状態で凍結乾燥プロセスを停止します。ビーカーを取り外し、すぐに付属のネジキャップで密封します。
まず、1.5グラムのミセリアと粉砕ボールをボールミルの粉砕瓶に加えます。25ヘルツで菌体粉末を30秒間粉砕し、15ミリリットルの遠心管に菌体粉末を移します。チューブを傾けてその後のミセリアとバッファーの混合を可能にし、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む6ミリリットルの氷冷抽出バッファーB250を加え、菌体粉末のグラム当たり、粗抽出物の完全な均質化が達成されるまで小さなへらとブレンドします。
次にチューブとバランスチューブを遠心分離機に入れ、40,000倍g、最低20分間摂氏4度で回転します。遠心分離の間、IgG樹脂を平衡化するために10ミリリットルの使い捨てクロマトグラフィーカラムをセットします。ピペット300マイクロリットルのよく再懸濁されたIgG樹脂をカラムに入した。
B250で10ミリリットルにカラムを充填し、バッファーが重力で流れます。1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むB250の1ミリリットルを追加し、それを流れさせ、その後、カラムの底部を差し込みます。遠心分離後、SDS-PAGE分析のために上清の10マイクロリットルを除去する。
サンプルを40マイクロリットルの水と5X LSBの12.5マイクロリットルを含む1.5ミリリットルのチューブに入れます。血清ピペットを使用して、上清を慎重に取り出し、平衡化されたIgGビーズを含むカラムに移します。指定されたエンドキャップをしっかりと固定して、列を閉じます。
まず、ロータリーミキサーのクロマトグラフィーカラムを10 rpmで、摂氏4度で2~4時間インキュベートします。この後、キャップを取り外し、下部の列を開いてフロースルーを収集します。柱を洗浄するには、ピペッタを使用して、洗浄バッファー250の1ミリリットルをカラムキャップに加えて閉じ込められたビーズを取り除き、この懸濁液を1回のフラッシュで落ち着いた樹脂に移してビーズを再中断する。
次いで、洗浄バッファー250で上部までカラムを充填し、蠕動ポンプに接続されたスタックキャップを使用して閉じる。蠕動ポンプを起動し、ポンプを毎分約1〜5ミリリットルの流量に調整し、この洗浄プロセスを合計4回の洗浄のために繰り返し、TEV平衡バッファーを使用してこの洗浄プロセスを3回繰り返します。下部のクロマトグラフィーカラムを閉じます。
IgGビーズをTEV切断バッファーの1ミリリットルに再懸濁し、20マイクロリットルの50Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと10マイクロリットルのTEVを追加します。次にカラムをキャップし、10 rpmでロータリーミキサーでインキュベートし、一晩で摂氏4度でインキュベートし、タグ付きHDACを介して結合したタンパク質複合体を溶出させます。翌日、柱を開き、2ミリリットルの遠心分離管に溶出物を集めます。
キャップからビーズを取り除き、柱の壁をすすいでいるためにTEV切断バッファーの0.7ミリリットルを使用してください。2ミリリットルの遠心分離管を50ミリリットルの遠心管に入れ、開いた2ミリリットルチューブに柱を置きます。このアセンブリ全体を卓上遠心分離機に移し、300回gで2分間回転し、TEV溶出を得ます。
本研究では、糸状菌アスペルギルスニデュランからのTAPタグ付きクラス1 HDACのシングルステップ濃縮が、インビトロ・デアクチル酵素活性の評価のために行われる。この典型的な結果は、タンデム精製を行う場合にさらに増加される第1の親和性ステップの有効性を明確に示す。しかし、タンパク質抽出物およびフロースルーに存在する顕著なタンパク質のほとんどは、TEV溶出物ですでに枯渇している。
免疫ブロットは、TEV溶出物中のCBPタグ付き全長RpdA、カルモジュリンフロースルー、および溶出画分に対応する約120キロダルトンで移動する強いシグナルを示す。特定のHDAC阻害剤Trichostatin Aを用いた代表的なデアクチラーゼ活性アッセイをここに示す。活性の感度は、測定値がRpdAによるものであり、非特異的プロテアーゼ活性によって引き起こされないことを確認する。
これは、かなり高濃度で存在するTEVプロテアーゼがHDAC活性アッセイに干渉しないことを示すため重要である。興味深いことに、HDAC活性は、第2のアフィニティー精製工程、CE、TEV溶出物と比較した後に有意に低下する。効率的なタンパク質抽出を可能にするために、ミセリアが微粉に粉砕されていることを確認してください。
これは、機械が利用できず、モルタルや害虫を研削に使用する場合に特に重要です。プロトコルに第2の親和性ステップを追加すると、タンパク質同定に十分に純粋な画分が得られますが、質量分析で行われます。液体窒素を使用する場合は、人身傷害を避けるために安全ゴーグルと保護手袋を着用してください。
