この実験手順の全体的な目標は、ヒトサイトメガロウイルス即時早期プロモーターの制御下で細菌人工染色体に組み立てられた全長cDNAクローンからの感染性組換えジカウイルスの生成である。ジカウイルスなどのRNAウイルスの逆遺伝子システムの開発により、ウイルスゲノムの直接操作は、ウイルス生物学と病因の複数の側面を研究し、ワクチン戦略を開発することができます。この技術の主な利点は、細菌人工染色体としてのジカウイルス感染性クローンの構築がフラビウイルスゲノムに関連する毒性を克服し、BAC cDNAクローンを感受性細胞に直接トランスフェクションすることによって感染性ウイルスを救い出すことができる点である。
この方法論は、他のフラビウイルスおよび他の陽性鎖RNAウイルスに対する安定した完全に機能する感染性cDNAクローンの構築に適用することができる。この手順を開始するには、適切な制限サイトを使用して、テキストプロトコルで概説されているようにジカウイルスcDNAクローンを構築します。5素端のヒトCMVプロモーターと3素端のウシ成長ホルモン終了およびポリアデニル化配列によって横たわるジカウイルスゲノムにまたがる4つのDNA断片は、細菌性人工染色体プラスミドに組み立てられる。
まず、pBAC-ジカウイルス感染クローンを5ミリリットルのLB培地に含むpBAC-ジカウイルス感染クローンを、穏やかな揺れで摂氏37度で8時間運ぶ大腸菌DH10Bの単一コロニーを成長させる。次いで、クロラムフェニコールを含むLB培地を500ミリリットルの2リットルフラスコに加える。調製した細菌培養物を1ミリリットルをフラスコに加え、OD600が約0.6~0.8になるまで14〜16時間摂氏37度で細胞を増殖させます。
この後、BAC精製用に開発された市販キットを使用して、製造者の指示に従ってアルカリ性のリシスによりBAC感染cDNAクローンを精製する。トランスフェクションの1日前に、ベロ細胞を成長培地中のウェルあたり500,000個の密度で6ウェルプレートのウェルにプレートします。トランスフェクションミックスを調製するには、BAC cDNAクローンの4マイクログラムを250マイクロリットルの血清還元培地に加え、慎重に混合します。
別のチューブでは、250マイクロリットルの血清還元培地で12マイクロリットルのトランスフェクション剤を希釈する。室温で5分間混合し、インキュベートするボルテックス。次に、希釈したBAC cDNAをトランスフェクション剤と組み合わせます。
慎重に混ぜ、室温で20〜30分間インキュベートします。このインキュベーション期間中、抗生物質を使わずに増殖培地を使用してVero細胞を洗浄し、抗生物質を使わずに1ミリリットルの新鮮培地に細胞を残します。次いで、500マイクロリットルのcDNAおよびトランスフェクション試薬混合物をセロ細胞上に滴下して分配する。
プレートを前後に揺らし、加湿したインキュベーターで5%の二酸化炭素を6時間混合し、加湿インキュベーターにインキュベートします。この後、トランスフェクション培地を取り除き、抗生物質で新鮮な成長培地を2ミリリットル加えます。5%の二酸化炭素で摂氏37度の加湿インキュベーターで細胞をインキュベートし、細胞パシー効果の誘導を毎日チェックしてください。
トランスフェクションの4〜6日後、CPEが約50〜75%である場合、細胞の破片を除去するために15ミリリットルの円錐管および遠心分離機で組織培養上清を10分間収集する。次いで、組換えジカウイルスを含む上清を収穫し、細胞ペレットを廃棄する。クライオチューブで上清をアリコートし、マイナス80度で保存します。
まず、ベロ細胞を90%合流まで増殖させます。細胞をPBSで2回洗浄し、2%FBSを含む増殖培地において0.1の感染の多重度で救出されたウイルスに感染させる。90分間の吸着期間は、5%の二酸化炭素と15分ごとに揺れる37°Cの加湿インキュベーターに細胞のプレートを置きます。
ウイルス吸着後、ウイルス接種を除去し、2%FBSで新たな成長培地を添加する。前に使用したのと同じ条件で3〜4日間インキュベートする。CPEが約75%の場合、組織培養上清と遠心分離機を収集して細胞の破片を除去する。
次いで、組換えジカウイルスを含む上清を収穫し、ペレットを廃棄する。上清をクライオチューブにアリコートする。チューブを凍った箱に入れ、マイナス80度で保管します。
準備ができたら、フリーザーからウイルスアリコートを取り除き、テキストプロトコルに概説されているようにプラークアッセイによってウイルスのチターを決定する。本研究では、ジカウイルス株リオグランデ・ド・ノルテ・ナタールの安定した全長cDNAクローンは、従来のクローニング法とウイルスゲノムに存在するユニークな制限部位を用いて、4つの重なり合うcDNA断片を細菌人工染色体pBeloBAC111に順次クローニングすることによって生成される。この全長cDNAクローンは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターによって5プライムエンドに横たわり、トランスフェクトされた細胞の核内および3プライム末端で、肝炎デルタウイルスリボソームによる3プライムエンドで、続いてウシ成長ホルモン終了およびポリアデニル化配列を続けて、ウイルスゲノムの正確な3プライムエンドを含むRNAを産生した。
BAC cDNAが組み立てられると、カチオンリポソームを用いたBAC cDNAクローンを用いた感受性ベロ細胞の直接トランスフェクション後に、感染性ウイルスを容易に回収することができる。このアプローチを使用して、RジカウイルスRGNは1ミリリットル当たり100万個以上のプラーク形成単位を持つタイターで救助することができる。さらに、救出されたウイルスは明確な細胞病的効果を誘発し、約2ミリメートルの大きさの均質なプラークを生成する。
救出されたウイルスの同一性は、ジカウイルスEタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光分析によって確認される。全体として、これらの結果は、感染性組換えジカウイルスがBACに組み立てられた全長cDNAクローンから救出できることを示している。要約すると、我々は、病理学の研究を容易にし、ワクチンを開発し、抗ウイルス活性を有する薬物の同定を容易にするために、他の陽性鎖RNAウイルスのcDNAクローンで安定した機能的感染を生成するために適応することができる細菌人工染色体の使用に基づいて強力なジカウイルス逆遺伝的アプローチを開発した。
