このプロトコルの意義は、様々な真核細胞におけるタンパク質修飾体のSUMOの検出に新しい蛍光SUMOトラップUTAGタンパク質を用いることが重要である。この技術の主な利点は、哺乳類組織培養および線虫性腺を含む様々な細胞におけるSUMOの抗体を含まない検出のための簡単なプロトコルである。SUMOはがんや神経変性疾患において重要な役割を果たしており、SUMO改変タンパク質の検出と機能解析のための堅牢で信頼性の高いツールの必要性を強調しています。
SUMOは高度に保存されているため、蛍光SUMOトラップUTAGタンパク質を使用して、多くの異なる生物で共役スモを標識することができます。このビデオは、哺乳類細胞での使用を示しています。また、全文は線虫の卵母細胞での使用について説明する。
この技術の視覚的なデモンストレーションは、染色およびSUMO検出前の細胞の治療のための重要なヒントを提供する。まず、70〜80%コンフルエントまで6ウェルTCプレートの22ミリメートルの丸いカバースリップで選択した組織培養細胞を成長させます。1ミリリットルのDPBSで細胞を短時間洗います。
細胞を固定するには、新鮮な4%PFAとDPBSの2ミリリットルを各ウェルに加えます。室温で20分間細胞をインキュベートする。固定細胞を1ミリリットルのDPBSで5分間3回洗浄し、プレートを仕上げながら洗浄します。
細胞を透過し、DPBSで1%トリトンX-100で15分間インキュベートする。前のように、細胞をもう一度洗います。500マイクロリットルの1モルグリシンHCL pH2を10秒間インキュベートします。
次に、10X SUMOプロテアーゼバッファー、またはSPBの500マイクロリットルですぐにpHを中和します。以前のように細胞を洗浄した後、ウェルからカバースリップを取り除き、湿度チャンバーに入れます。UTAG-FL染色の場合のみ、チューブ内に5ミリモルTCEPを含む1X SPBの100マイクロリットルとUTAG-FLの1マイクログラムを混合してください。
次いで、カバースリップ上の細胞にピペットを混ぜ、湿度チャンバ内で1時間室温でインキュベートする。カバースリップを洗浄するには、各カバースリップに200マイクロリットルのDPBSをピペットし、10分間所定の位置に残します。さらに2回洗い流します。
最後の洗浄からカバースリップを取り外し、取り付け媒体の滴で事前に洗浄された顕微鏡スライドに反転します。顕微鏡で見る前に、サンプルを摂氏20度の冷凍庫に一晩保管してください。DAPI とテキサスレッドの適切なフィルター セットを使用してセルを視覚化します。
SUMO と固定線虫腺のラベル付け方法に関するプロトコルの全文を参照してください。哺乳類細胞の標識は非常に簡単ですが、線虫卵母細胞を標識するには、生殖腺解剖の事前トレーニングが必要です。固定PMT2細胞をインキュベートしたKmUTAG-FLは、明確な核染色を示した。
拡散核染色と明確な核病巣の両方が見えました。核局在化はDAPIとの共染色を用いて確認した。KmUTAG-FLのSUMO捕捉活性と一致して、核局在パターンはSUMO23染色を連想させる。
抗SUMO23 8A2抗体による共染色により、SumO23シグナルによるKmUTAG-FLの共局在化が確認された。これは、哺乳動物細胞におけるSUMO23を検出するKmUTAG-FLの有効性を検証する。卵母細胞産生成人雌雄同体cから単離された生殖腺。
エレガンス線虫は抗SUMO抗体で標識した。以前の報告と一致して、抗SUMO抗体は、初期筋性気相卵母細胞の核プラスムに最初に局在した。その後、核封筒が分解し、染色体がメタフェーズプレートに向かってコングレスされると、ペアのホモログの中央環複合体に再配布されました。
並行して、KmUTAG-FLで標識された生殖腺も同様のパターンを明らかにした。KmUTAG-FLは、卵母細胞が始まり、核エンベロープ分解のプロセスを完了するにつれて、核内皮の標識から環状複合体に集中することに移行した。これらの結果は、Cの筋症およびSUMO関連プロセスの分析に役立つツールとしてKmUTAG-FLを検証する。
エレガンスとおそらく他の線虫。固定を行う間、新鮮なパラホルムアルデヒドと短い固定時間を使用して、SumOをネイティブに折りたたんでKmUTAGで認識できるようにしておくことが重要です。SUMOの三次構造は高度に保存されているため、追加モデルおよび非モデル系のSUMO変異体をKmUTAG-FL試薬で解析できる可能性が非常に高い。
現在、この新しい蛍光相撲捕捉UTAGタンパク質を用いて、細胞ストレス時のSUMOの機能を研究しています。最後に、固定パラホルムアルデヒドを使用するすべてのステップは、実験室の安全フードで行われるべきであり、この試薬は適切に処分されなければならないことに注意してください。
