Bu protokolün önemi çeşitli ökaryotik hücrelerde protein değiştirici SUMO tespiti için yeni bir floresan SUMO-yakalama UTAG proteinkullanımıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, memeli doku kültürü ve nematod gonadları da dahil olmak üzere çeşitli hücrelerde SUMO'nun antikorsuz olarak algılanması için basit bir protokoldür. SUMO kanser ve nörodejeneratif bozukluklarda önemli roller oynar ve bu da SUMO modifiye edilmiş proteinlerin saptanması ve fonksiyonel analizi için sağlam ve güvenilir araçlara duyulan ihtiyacın altını çizer.
SUMO çok iyi korunduğundan, floresan SUMO yakalama UTAG proteini birçok farklı organizmada konjuge SUMO'yu etiketlemek için kullanılabilir. Bu video memeli hücrelerinde kullanımını göstermektedir. Buna ek olarak, tam metin nematod oositler kullanımını açıklar.
Bu tekniğin görsel gösterimi, boyama ve SUMO tespiti nden önce hücrelerin tedavisi için kritik ipuçları sağlar. Başlamak için, 22 milimetrelik yuvarlak kapak üzerinde tercih doku kültürü hücreleri büyümek kadar altı iyi TC plakaları içinde fişleri 70-80% confluent. Hücreleri bir mililitre DPBS ile kısa bir süre yıkayın.
Hücreleri düzeltmek için, her kuyuya iki mililitre taze %4 PFA ve DPBS ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sabit hücreleri bir mililitre DPBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve tabağı somunlayın.
Hücreleri permeabilize etmek için, DPBS%1 Triton X-100 ile 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri eskisi gibi tekrar yıkayın. Hücreleri 10 saniye boyunca 1 molar glisin HCL pH 2 500 mikrolitre ile kuluçkaya yatırın.
Daha sonra 10X SUMO Proteaz tampon 500 mikrolitre ile hemen pH nötralize, veya SPB. Hücreleri eskisi gibi yıkadıktan sonra kapak fişlerini kuyudan çıkarın ve nem odasına yerleştirin. Sadece UTAG-FL boyama için, bir tüpte beş milimolar TCEP içeren 1X SPB 100 mikrolitre ile UTAG-FL bir mikrogram karıştırın.
Daha sonra, pipet kapağı kayma hücreleri üzerine karışımı ve nem odasında bir saat oda sıcaklığında kuluçka. Kapak fişlerini yıkamak için, pipet 200 mikrolitre DPBS her kapak üzerinde kayma ve yerinde 10 dakika bekletin. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
Kapak fişlerini son yıkamadan çıkarın ve bir damla montaj ortamıyla önceden temizlenmiş bir mikroskopi slaytına ters çevirin. Örnekleri mikroskop altında görüntülemeden önce bir gecede 20 derece lik bir dondurucuda saklayın. DAPI ve Texas Red için uygun filtre kümelerini kullanarak hücreleri görselleştirin.
Sumo ve sabit nematod gonadları nasıl etiketlenir konusunda bir protokol için tam metne bakın. Memeli hücrelerini etiketleme oldukça basit iken, nematod oositetiketleme gonad diseksiyonları önceden eğitim gerektirir. KmUTAG-FL sabit PMT2 hücreleri ile kuluçka belirgin bir nükleer boyama gösterdi.
Hem yaygın nükleer boyama hem de farklı nükleer odaklar görülüyordu. Nükleer lokalizasyon DAPI ile birlikte boyama kullanılarak doğrulandı. KmUTAG-FL'nin SUMO yakalama aktivitesi ile tutarlı olarak, nükleer lokalizasyon deseni SUMO23 boyamasını andırıyordu.
Anti-SUMO23 8A2 antikor ile birlikte boyama SUMO23 sinyali ile KmUTAG-FL'nin birlikte lokalizasyonunu doğruladı. Bu memeli hücrelerinde SUMO23 tespit kmUTAG-FL etkinliğini doğrular. Yumurta üreten yetişkin hermafrodit c izole gonadlar.
elegans nematodlar anti-SUMO antikor ile etiketlendi. Önceki raporlarla tutarlı olarak, anti-SUMO antikor başlangıçta geç miyotik profaze oositlerin nükleer plazmına lokalize. Daha sonra nükleer zarf bozuldu ve kromozomlar metafaz plaka doğru kongre olarak eşleştirilmiş homologlar merkezi halka kompleksi yeniden dağıtıldı.
Paralel preparatlarda KmUTAG-FL etiketli gondlar da benzer desenler ortaya koymuştur. KmUTAG-FL, nükleoplazm etiketlemeden, yumurtalar nükleer zarf arıza işlemini başlatıp tamamladığı için halka kompleksine konsantre olmaya geçti. Bu sonuçlar KmUTAG-FL'yi c'deki miyozis ve SUMO ile ilgili süreçlerin analizinde yararlı bir araç olarak doğrular.
elegans ve muhtemelen diğer nematodlar. Fiksasyon yaparken, taze paraformaldehit ve KmUTAG tarafından tanınabilir böylece sumo doğal katlanmış tutmak için kısa bir fiksasyon süresi kullanmak önemlidir. SUMO'nun üçüncül yapısı son derece korunduğundan, ek model ve model olmayan sistemlerden SUMO varyantlarının KmUTAG-FL reaktifi ile analiz edilmesi çok olasıdır.
Şu anda, hücresel stres sırasında SUMO işlevini incelemek için bu yeni floresan SUMO-yakalama UTAG protein kullanıyoruz. Son olarak, fiksatif paraformaldehit kullanan tüm adımların bir laboratuvar güvenlik başlığında yapılması ve bu reaktifin düzgün bir şekilde atılması gerektiğini lütfen unutmayın.
