Die Bedeutung dieses Protokolls ist die Verwendung eines neuartigen fluoreszierenden SUMO-trapping UTAG-Proteins zum Nachweis des Proteinmodifizierers SUMO in verschiedenen eukaryotischen Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ein einfaches Protokoll für den antikörperfreien Nachweis von SUMO in einer Vielzahl von Zellen, einschließlich Säugetiergewebekultur und Nematodengonden. SUMO spielt eine wichtige Rolle bei Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen, was die Notwendigkeit robuster und zuverlässiger Instrumente für die Detektion und funktionelle Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen unterstreicht.
Da SUMO hochkonserviert ist, kann das fluoreszierende SUMO-trapping UTAG-Protein verwendet werden, um konjugierte SUMO in vielen verschiedenen Organismen zu kennzeichnen. Dieses Video zeigt seine Verwendung in Säugetierzellen. Darüber hinaus beschreibt der Volltext seine Verwendung in nematoden Oozyten.
Die visuelle Demonstration dieser Technik liefert kritische Hinweise für die Behandlung von Zellen vor der Färbung und SUMO-Erkennung. Zunächst können Gewebekulturzellen der Wahl auf 22-Millimeter-Rundabdeckungen in sechs bohren DEN TC-Platten bis zu 70 bis 80 % konfluent wachsen. Waschen Sie die Zellen kurz mit einem Milliliter DPBS.
Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter frische 4%PFA und DPBS hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die festen Zellen dreimal für fünf Minuten in einem Milliliter DPBS, während Sie die Platte verneinen.
Um die Zellen zu permeabilisieren, inkubieren Sie für 15 Minuten mit 1%Triton X-100 in DPBS. Waschen Sie die Zellen wieder, wie zuvor. Inkubieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern von 1 Molarglycin HCL pH 2 für 10 Sekunden.
Dann neutralisieren Sie den pH-Wert sofort mit 500 Mikroliter n10 SUMO Protease Puffer, oder SPB. Nach dem Waschen der Zellen wie zuvor, entfernen Sie die Abdeckung rutscht aus dem Brunnen und legen Sie sie in eine Feuchtigkeitskammer. Nur für UTAG-FL-Färbungeininformationen ein Mikrogramm UTAG-FL mit 100 Mikrolitern 1X SPB mit fünf Millimolaren TCEP in einem Rohr mischen.
Dann pipette die Mischung auf die Zellen auf der Abdeckung rutschen und inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde in der Feuchtigkeitskammer. Um die Abdeckung saugen rutscht, Pipette 200 Mikroliter DPBS auf jeder Abdeckung rutschen und lassen An Ort und Stelle für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche zwei weitere Male.
Entfernen Sie die Deckelscheine von der letzten Wäsche und kehren Sie auf einen vorgereinigten Mikroskopieschlitten mit einem Tropfen Montagemedium um. Lagern Sie die Proben über Nacht in einem 20 Grad Celsius Gefrierschrank, bevor Sie unter dem Mikroskop betrachten. Visualisieren Sie die Zellen mithilfe der entsprechenden Filtersätze für DAPI und Texas Red.
Bitte lesen Sie den vollständigen Text für ein Protokoll, wie Man SUMO und feste Nematoden-Gonaden beschriften kann. Während die Kennzeichnung von Säugetierzellen ziemlich einfach ist, erfordert die Etikettierung von Nematodenoozyten eine vorherige Ausbildung in Gonadensektionen. KmUTAG-FL inkubiert mit festen PMT2-Zellen zeigte eine deutliche nukleare Färbung.
Sowohl diffuse nukleare Färbung als auch ausgeprägte Kernbrennpunkte waren sichtbar. Die kerntechnische Lokalisierung wurde durch Co-Färbung mit DAPI bestätigt. In Übereinstimmung mit der SUMO-Fangaktivität von KmUTAG-FL erinnerte das nukleare Lokalisierungsmuster an die SUMO23-Färbung.
Die Co-Färbung mit Anti-SUMO23 8A2 Antikörpern bestätigte die Kolokalisierung von KmUTAG-FL mit dem SUMO23-Signal. Dies bestätigt die Wirksamkeit von KmUTAG-FL zum Nachweis von SUMO23 in Säugetierzellen. Isolierte Gonaden aus eizellenproduzierenden Erwachsenenhermaphrodit c.
Elegans Nematoden wurden mit Anti-SUMO-Antikörpern gekennzeichnet. In Übereinstimmung mit früheren Berichten lokalisierte Sichten antikörperzunächst das Kernplasma der späten myotischen Prophase-Oozyten. Es verteilte sich dann auf den zentralen Ringkomplex der gepaarten Homologe, als die Kernhülle zusammenbrach und die Chromosomen auf die Metaphasenplatte zusteuerten.
In parallelen Präparaten zeigten Mit KmUTAG-FL beschriftete Gonaden ähnliche Muster. KmUTAG-FL verlagerte sich von der Kennzeichnung des Nukleoplasmas hin zur Konzentration auf den Ringkomplex, als Eizellen begannen und den Prozess des Nuklearen Hüllenabbaus abschlossen. Diese Ergebnisse bestätigen KmUTAG-FL als nützliches Werkzeug für die Analyse von Myose- und SUMO-bezogenen Prozessen in c.
Elegans und möglicherweise andere Nematoden. Bei der Fixierung ist es wichtig, frisches Paraformaldehyd und eine kurze Fixierungszeit zu verwenden, um SUMO nativ gefaltet zu halten, so dass es von der KmUTAG erkannt werden kann. Da die tertiäre Struktur von SUMO sehr konserviert ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass SUMO-Varianten aus zusätzlichen Modell- und Nicht-Modellsystemen mit dem KmUTAG-FL-Reagenz analysiert werden können.
Derzeit verwenden wir dieses neuartige fluoreszierende SUMO-Trapping-UTAG-Protein, um die Funktion von SUMO während zellulären Stresses zu untersuchen. Bitte beachten Sie abschließend, dass alle Schritte mit dem fixativen Paraformaldehyd in einer Sicherheitshaube des Labors durchgeführt werden müssen und dieses Reagenz ordnungsgemäß entsorgt werden muss.
