이 프로토콜의 중요성은 다양한 진핵 세포에서 단백질 수정자 SUMO의 검출을 위한 새로운 형광 SUMO-트래핑 UTAG 단백질의 사용이다. 이 기술의 주요 장점은 포유류 조직 배양 및 선충 고나드를 포함한 다양한 세포에서 SUMO의 항체 없는 검출을 위한 간단한 프로토콜이다. SUMO는 암 과 신경 퇴행성 질환에서 중요한 역할을하며, 이것은 SUMO 변형 단백질의 검출 및 기능 분석을위한 견고하고 신뢰할 수있는 도구의 필요성을 강조합니다.
SUMO는 매우 보존되기 때문에 형광 수모 트래핑 UTAG 단백질을 사용하여 다양한 유기체에서 공액 수모를 라벨로 지정할 수 있습니다. 이 비디오는 포유류 세포에서의 사용을 보여줍니다. 또한 전체 텍스트에서는 선충 난모세포에서의 사용을 설명합니다.
이 기술의 시각적 데모는 염색 및 SUMO 검출 전에 세포의 치료에 대한 중요한 힌트를 제공합니다. 시작하려면, 70 ~ 80 %의 컨할 때까지 6 웰 TC 플레이트에서 22 밀리미터 둥근 커버 슬립에 선택의 조직 배양 세포를 성장. DPBS의 1 밀리리터로 세포를 간략하게 씻으시면 됩니다.
세포를 고치려면 각각 4%의 PFA와 DPBS의 2밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 20 분 동안 세포를 배양하십시오. 플레이트를 누두하는 동안 DPBS의 1 밀리리터에서 5 분 동안 고정 된 세포를 세 번 씻으면 하십시오.
세포를 과소화하려면 DPBS에서 1%트리톤 X-100으로 15분 동안 배양합니다. 이전과 같이 세포를 다시 씻으십시오. 10 초 동안 1 어금니 글리신 HCL pH 2의 500 마이크로 리터로 세포를 배양합니다.
그런 다음 10X SUMO 프로테제 버퍼 또는 SPB의 500 마이크로리터로 pH를 즉시 중화시합니다. 이전과 같이 세포를 세척 한 후, 우물에서 덮개 전표를 제거하고 습도 챔버에 배치합니다. UTAG-FL 염색 전용의 경우 UTAG-FL 의 마이크로그램 1개에 튜브에 5밀리머 TCEP를 함유한 1X SPB 100마이크로리터를 혼합합니다.
그런 다음, 피펫커버 슬립의 셀에 혼합하고 습도 챔버에서 1 시간 동안 실온에서 배양한다. 커버 슬립을 세척하려면 각 커버 슬립에 DPBS 의 파이펫 200 마이크로 리터를 놓고 10 분 동안 제자리에 둡니다. 세탁을 두 번 더 반복합니다.
마지막 세척에서 커버 슬립을 제거하고 장착 매체의 드롭과 미리 청소 현미경 슬라이드에 반전. 현미경으로 보기 전에 하룻밤 동안 섭씨 20도 냉동고에 샘플을 저장합니다. DAPI 및 텍사스 레드에 적합한 필터 세트를 사용하여 셀을 시각화합니다.
SUMO 및 고정 선충 고라드에 라벨을 붙이는 방법에 대한 프로토콜에 대한 전체 텍스트를 참조하십시오. 포유류 세포를 표시하는 것은 아주 간단합니다, 선충 난모세포를 표시하는 것은 gonad 해부에서 사전 훈련이 필요합니다. 고정 PMT2 세포로 인큐베이션된 KmUTAG-FL은 뚜렷한 핵 염색을 보였다.
확산 핵 염색과 뚜렷한 핵 포시가 모두 눈에 띄어졌다. 원자력 국산화는 DAPI와 공동 염색을 사용하여 확인되었다. KmUTAG-FL의 SUMO 트래핑 활동과 일치하여 핵 국소화 패턴은 SUMO23 염색을 연상시킵니다.
항 SUMO23 8A2 항체와 공동 염색하면 SUMO23 신호와 KmUTAG-FL의 공동 국소화를 확인했습니다. 이것은 포유류 세포에서 SUMO23을 검출하기 위하여 KmUTAG-FL의 효험을 검증합니다. 난구를 생산하는 성인 헤르마플로디테 c에서 분리 된 고나드.
아레간 선충은 항 SUMO 항체로 표지되었다. 이전 보고서와 일치, 항 SUMO 항체는 처음에 후기 근막 성 프자상 난모세포의 핵 플라스엠에 국한. 그런 다음 핵 봉투가 고장나면서 쌍이 있는 동종로의 중앙 고리 단지로 재분배되고 염색체가 메타위상 판을 향해 모았다.
병렬 준비에서 KmUTAG-FL으로 표시된 생식선은 비슷한 패턴을 드러냈습니다. KmUTAG-FL은 핵봉투 분해 과정을 시작하고 완료함에 따라 핵표지에서 링 컴플렉스에 집중하는 것으로 전환했습니다. 이러한 결과는 KmUTAG-FL을 c에서 근시 및 SUMO 관련 프로세스의 분석을 위한 유용한 도구로 검증합니다.
예인대와 아마도 다른 선충. 고정을 수행하는 동안, 신선한 파라포름알데히드와 짧은 고정 시간을 사용하여 KmUTAG에서 인식할 수 있도록 SUMO를 기본적으로 접지하는 것이 중요합니다. SUMO의 고등 구조는 매우 보존되어 있기 때문에 KmUTAG-FL 시약으로 추가 모델 및 비모델 시스템의 SUMO 변형을 분석할 수 있습니다.
현재, 우리는 이 새로운 형광 수모 트래핑 UTAG 단백질을 사용하여 세포 스트레스 시 SUMO의 기능을 연구하고 있습니다. 마지막으로, 고정 파라포름알데히드를 사용하는 모든 단계는 실험실 안전 후드에서 수행되어야하며이 시약은 올바르게 폐기해야합니다.
