Il significato di questo protocollo è l'uso di una nuova proteina UTAG fluorescente che intrappola sumo per il rilevamento del modificatore proteico SUMO in varie cellule eucariotiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è un protocollo semplice per il rilevamento senza anticorpi di SUMO in una varietà di cellule, tra cui la coltura del tessuto dei mammiferi e le gonadi nematode. SUMO svolge ruoli importanti nel cancro e nei disturbi neurodegenerativi, e questo sottolinea la necessità di strumenti robusti e affidabili per il rilevamento e l'analisi funzionale delle proteine modificate suMO.
Poiché il SUMO è altamente conservato, la proteina UTAG fluorescente che intrappola il SUMO può essere utilizzata per etichettare il SUMO coniugato in molti organismi diversi. Questo video dimostra il suo uso nelle cellule dei mammiferi. Inoltre, il testo completo descrive il suo uso negli ovociti nematodi.
La dimostrazione visiva di questa tecnica fornisce suggerimenti critici per il trattamento delle cellule prima della colorazione e del rilevamento sumo. Per iniziare, far crescere le cellule di coltura tissutale di scelta su coperchi rotondi di 22 millimetri scivola in piastre TC a sei pozzi fino al 70-80% confluente. Lavare brevemente le cellule con un millilitro di DPBS.
Per fissare le celle, aggiungere due millilitri di 4%PFA e DPBS freschi a ciascun pozzo. Incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle fisse tre volte per cinque minuti in un millilitro di DPBS mentre si nuta la piastra.
Per permeabilizzare le cellule, incubare per 15 minuti con 1%Triton X-100 in DPBS. Lavare di nuovo le cellule, come prima. Incubare le cellule con 500 microlitri di 1 glicina molare HCL pH 2 per 10 secondi.
Quindi neutralizzare immediatamente il pH con 500 microlitri di tampone 10X SUMO Protease, o SPB. Dopo aver lavato le celle come prima, rimuovere i coperchi dal pozzo e posizionarli in una camera di umidità. Solo per la colorazione UTAG-FL, mescolare un microgrammo di UTAG-FL con 100 microlitri di 1X SPB contenenti cinque TCEP millimolare in un tubo.
Quindi, pipettare il mix sulle cellule sul coperchio scivolare e incubare a temperatura ambiente per un'ora nella camera di umidità. Per lavare i coperchi, pipettare 200 microlitri di DPBS su ogni slittamento del coperchio e lasciare in posizione per 10 minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte.
Rimuovere i coperchi dall'ultimo lavaggio e invertire su uno scivolo di microscopia pre-pulito con una goccia di mezzo di montaggio. Conservare i campioni durante la notte in un congelatore a 20 gradi Celsius prima di visualizzarsi al microscopio. Visualizzare le celle utilizzando i set di filtri appropriati per DAPI e Texas Red.
Si prega di consultare il testo completo per un protocollo su come etichettare SUMO e gonadi nematodi fissi. Mentre l'etichettatura delle cellule di mammifero è piuttosto semplice, l'etichettatura degli ovociti nematodi richiede un addestramento preliminare nelle dissezioni di gonadi. KmUTAG-FL incubato con cellule PMT2 fisse ha mostrato una colorazione nucleare distinta.
Erano visibili sia la colorazione nucleare diffusa che i distinti focolai nucleari. La localizzazione nucleare è stata confermata utilizzando la co-colorazione con DAPI. Coerentemente con l'attività di cattura sumo di KmUTAG-FL, il modello di localizzazione nucleare ricordava la colorazione SUMO23.
La co-colorazione con anticorpo anti-SUMO23 8A2 ha confermato la co-localizzazione di KmUTAG-FL con il segnale SUMO23. Ciò convalida l'efficacia di KmUTAG-FL per rilevare SUMO23 nelle cellule di mammifero. Gonadi isolate dall'enfafrodite adulta produttrice di ovociti c.
I nematodi elegani sono stati etichettati con anticorpi anti-SUMO. Coerentemente con i rapporti precedenti, anticorpo anti-SUMO inizialmente localizzato nel plasma nucleare degli ovociti prophase miotici tardi. Quindi si ridistribuì al complesso ad anello centrale degli omologhi accoppiati quando l'involucro nucleare si ruppe e i cromosomi si congressarono verso la piastra metafase.
Nei preparati paralleli, le gonadi etichettate con KmUTAG-FL hanno rivelato modelli simili. KmUTAG-FL si spostò dall'etichettatura del nucleoplasma alla concentrazione sul complesso ad anello quando gli ovociti iniziarono e completarono il processo di rottura dell'involucro nucleare. Questi risultati convalidano KmUTAG-FL come strumento utile per l'analisi della miosi e dei processi relativi al SUMO in c.
elegani ed eventualmente altri nematodi. Durante l'esecuzione della fissazione, è fondamentale utilizzare paraformaldeide fresca e un breve tempo di fissazione per mantenere SUMO piegato nativamente in modo che possa essere riconosciuto dal KmUTAG. Poiché la struttura terziaria di SUMO è altamente conservata, è molto probabile che le varianti SUMO di sistemi aggiuntivi di modello e non modello possano essere analizzate con il reagente KmUTAG-FL.
Attualmente, stiamo usando questa nuova proteina UTAG fluorescente che intrappola sumo per studiare la funzione di SUMO durante lo stress cellulare. Infine, si prega di notare che tutte le fasi che utilizzano la paraformaldeide fissativa devono essere eseguite in una cappa di sicurezza di laboratorio e questo reagente deve essere smaltito correttamente.
