広く用いられているプローブCFDA、またはカルボキシフルオレセインジアセテートの略は、非蛍光性である。この化合物上の2つのH3基と3'6'位置は、膜透過をレンダリングします。細胞内に一度、細胞内の酢酸は、酢酸基を除去し、CFDAの新しい形態を放出します。
これは、カルボキシフルオレセイン、または蛍光であるCFです。そして、この新しい形態は膜透過性が低いため、重量、すべての細胞は細胞間細孔、または植物のプラスモデマタを移動するものであり、これはフロエム活性における細胞間輸送を研究するのに理想的なプローブです。今日のビデオでは、それぞれシロイヌナズナズ植物の根元と低コチルへのCFDローディングを実証し、2つのわずかに異なる手順がこの蛍光プローブの底から上の動きにどのように影響するかを示します。
一貫して染色結果を達成し、我々は4摂氏度、40%の水分キャビネットで収穫したシロイヌナズナの種子を保存します。この状態で7日以上保存された新しく収穫された種子は、播種に容易に使用されます。すべての植物がペトリ皿の比較的類似したスペースで栽培されていることを確認するために、我々は種子ゾーングレードカードを使用しています。
さて、殺菌された先端を湿らし、殺菌された種に浸し、指定された位置に種を1つずつまいた。種まきが終わったら、ペトリ皿をパラフィルムと粘着テープで密封し、ペトリ皿スタンドに置いて垂直に成長させる。この実験で使用するツールを次に示します。
できるだけ早く染料をロードした方が良いことに注意してください。通常、10分から15分で全体のプロセスを終了します。CFDAローディング実験を行う前に、常に新鮮なCFDA溶液を準備します。
ここで、1ミリモルCFDAを水で5マイクロモル濃度に希釈してからすぐに使用する。パラフィルムを3ミリメートルの小片に切ります。ペトリ皿の蓋と底に結露があるので、染料が流れ回らないようにペーパータオルで片付ける必要があります。
小さなパラフィルムピースが根の下に置かれます。植物を持ち上げて蓋の上に置きます。根を約5~10ミリメートル下に切ります。
パラフィルムの小片に撮影を取り戻します。今慎重に根の切断端に1マイクロリットルCFDAを適用します。すべての原植物を汚染しないようにしてください。
その後、蓋を覆い、成長室に2時間放置します。低コチルピンチ法。小さなパラフィルムピースは、以前に準備したように、根-低コチル接合部の下に置かれます。
私たちは、根組織の近くに優しく低コチルをつまむために前置きを使用し、慎重につままれた側に0.1マイクロリットルCFDAを適用し、2時間植物を残します。ゾーン染色植物の9から12日目までの写真。それらはすべて、コチルドンと真の葉の両方で血管染色パターンを示す。
非常にまれなケースでのみ、コチルドン葉は半葉染色パターンを示した。したがって、基本的に、2つの方法はCF染色パターンに違いは見えませんでしたが、染料をますます多くの植物にロードすると、2つの手順が効率の大きな違いを生み出すことがわかります。根切り法では、約70%の植物が撮影中の蛍光シグナルを示します。
しかし、この効率は、低コチルピンチ法を用いて91%まで向上させることができる。根挟み方法も試みたが、この方法は更に低い効率で、約30%なので、染料をロードする方法は染色の違いを考慮していないようだ。最も違いは、おそらく、シンプラスチックバリアによって分離されている可能性があり、ローディングサイトにあります。
我々は、CFDAをシロイヌナズナの根と低血糖にロードする方法を示した。2つのわずかに異なる手順を使用し、これら2つのわずかに異なる手順は、この底から上のプローブの動きに大きな違いをもたらします。この方法は、ルート由来のシュートワード信号の潜在的な共塑性バリアを特定するのに役立つ可能性があることを示唆しています。
