널리 사용되는 프로브 CFDA, 또는 카복시 플루오레세인 이아세이산에 대한 짧은, 비 형광이다. 이 화합물에 대한 두 개의 H3 그룹과 3'6'위치는 멤브레인 퍼미티드렌더링합니다. 일단 세포 안쪽에, 내부 세포 아세테이트는 아세테이트 단을 제거하고 CFDA의 새로운 양식을 풀어 놓을 것입니다.
그것은 형광인 카복시 플루오레세인 또는 CF입니다. 그리고 이 새로운 형태는 막 에 대한 왜곡이 적기 때문에, 무게, 모든 세포는 세포 간 모공, 또는 식물의 플라스모데마타를 통해 이동하는 것입니다, 그 말막 활동에서 세포 간 수송을 연구하는 이상적인 프로브를 diacetate만드는. 오늘의 비디오에서, 우리는 각각 아라비도시스 식물의 뿌리와 hypocotyl에 CFD 로딩을 시연 할 것입니다, 우리는 두 개의 약간 다른 절차가이 형광 프로브의 상단 움직임에 바닥에 영향을 미치는 방법을 보여줍니다.
지속적으로 염색 결과를 달성, 우리는 4 섭씨, 40 %의 수분 캐비닛에 수확 된 애기장염 씨앗을 저장합니다. 7 일 이상이 조건에 저장 된 새로 수확 된 씨앗은 파종에 쉽게 사용됩니다. 모든 식물이 페트리 접시의 비교적 유사한 공간에서 재배되도록 하기 위해 종자 구역 등급 카드를 사용하고 있습니다.
이제 살균 된 팁을 적시고 멸균 된 씨앗에 담그고 지정된 위치에 하나씩 씨앗을 뿌리는다. 파종을 마친 후, 페트리 접시에 파라필름과 끈적끈적한 테이프를 밀봉하여 페트리 접시 스탠드에 올려 수직으로 자랄 수 있습니다. 이 실험에서 사용할 도구는 다음과 같습니다.
가능한 한 빨리 염료를 더 잘 적재할 수 있습니다. 일반적으로 전체 프로세스를 10~15분 만에 완료합니다. CFDA 로딩 실험을 수행하기 전에 항상 새로운 CFDA 솔루션을 준비합니다.
여기서, 즉시 사용하기 전에 물로 1 밀리머 CFDA를 5 개의 마이크로 몰라 농도로 희석하십시오. 파라필름을 3mm 크기로 작은 조각으로 자른다. 페트리 접시의 뚜껑과 바닥에 응축이 있기 때문에, 우리는 주위에 흐르는 염료를 피하기 위해 종이 타월로 그들을 취소해야합니다.
작은 파라필름 조각이 뿌리 아래에 놓여 있습니다. 식물을 들어 올려 뚜껑에 놓습니다. 고체 코틸 아래 약 5 ~ 10 밀리미터 의 뿌리를 잘라.
파라필름의 작은 조각에 다시 촬영을 가져 가라. 이제 조심스럽게 루트의 절단 끝에 하나의 마이크로 리터 CFDA를 적용합니다. 모든 프로토 식물을 오염하지 않도록보십시오.
그런 다음 뚜껑을 덮고 2 시간 동안 성장실에 둡니다. 하이포코틸 꼬집기 방법. 이전에 준비된 작은 파라필름 조각은 뿌리-시코틸 접합하에 놓입니다.
우리는 조심스럽게 루트 조직에 가까운 hypocotyl을 꼬집기 위해 forecep를 사용하고, 조심스럽게 꼬집어 측에 0.1 마이크로 리터 CFDA를 적용하고 2 시간 동안 식물을 둡니다. 영역 염색 식물 후 9 일에서 12 일에서 사진. 그들은 모두 코틸레던과 진정한 잎 모두에서 혈관 염색 패턴을 보여줍니다.
매우 드문 경우에만, 코틸레톤 잎은 반 잎 염색 패턴을 보였다. 따라서 기본적으로 두 가지 방법은 CF 염색 패턴에 차이를 만들지 않았지만, 점점 더 많은 식물에 염료 로딩을 수행하면 두 절차가 효율성에 상당한 차이를 제공하는 것을 발견했습니다. 루트 컷 방법을 사용하면 식물의 약 70 %가 촬영시 형광 신호를 보여줍니다.
그러나 하이코틸 꼬집기 방법을 사용하여 효율성을 91%로 증가시킬 수 있다. 우리는 또한 루트 꼬집기 방법을 시도했지만,이 방법은 더 낮은 효율을 초래, 그것은 약 30 %따라서, 염색을로드하는 방법은 염색차이를 고려하지 않는 것으로 보인다. 차이점은 대부분 대두근 장벽으로 구분 될 수있는 로딩 사이트에있을 수 있습니다.
우리는 우리가 아랍염 뿌리와 hypocotyl에 CFDA를 로드하는 방법을 보여주었습니다. 우리는 두 개의 약간 다른 절차를 사용, 이 두 약간 다른 절차는 상단 프로브 움직임에이 하단에 상당한 차이를 초래. 이 방법은 뿌리 유래 촬영 신호에 대한 잠재적인 대두화 장벽을 식별하는 데 도움이 될 수 있다고 제안합니다.
