Широко используемый зонд CFDA, или короткий для карбоксифлюоресцента, не флуоресцентный. Две группы H3 и 3'6'позиции на этом соединении делают его мембранно-проницаемой. Где, оказавшись внутри клеток, внутренние клеточные ацетаты будут удалять группы ацетата и выпустить новую форму CFDA.
Это карбоксифлюорескейн, или CF, который флуоресцентный. И поскольку эта новая форма менее мембранно-проницаемая, вес, все клетки должны двигаться через межклеточные поры, или плазмодезмата в растениях, это делает этот диацетат идеальным зондом для изучения межклеточного транспорта в активности флеэма. В сегодняшнем видео, мы собираемся продемонстрировать CFD загрузки в корень и гипокотил растений Arabidopsis, соответственно, и мы покажем, как две немного разные процедуры будут влиять снизу вверх движение этого флуоресцентного зонда.
Достичь результатов окрашивания последовательно, мы храним собранные семена арабидопсиса в четыре степени Цельсия, 40%влаги шкаф. Недавно собранные семена, хранящиеся в этом состоянии более семи дней, легко используются для посева. Для того, чтобы каждое растение выращивали в относительно похожем пространстве в чашке Петри, мы используем карту класса семенной зоны.
Теперь, смачивая стерилизованный кончик, окунуться в стерилизованные семена, и посеять семена один за другим на назначенном положении. После завершения посева, печать Чашку Петри с парафильмом и липкой лентой, положить их на стенде чашки Петри, чтобы она расти вертикально. Вот инструменты, которые мы собираемся использовать в этом эксперименте.
Пожалуйста, обратите внимание, что нам лучше загрузить краситель так быстро, как мы можем. Как правило, вы закончите весь процесс в 10 до 15 минут. Перед тем, как провести эксперимент по загрузке CFDA, мы всегда готовим свежее решение CFDA.
Здесь разбавить один миллимоляр CFDA в пять микромоляных концентраций с водой, прежде чем немедленно использовать. Парафильм разрежьте на мелкие кусочки по три на три миллиметра. Потому что есть конденсат на крышке и нижней части чашки Петри, мы должны очистить их с бумажным полотенцем, чтобы избежать красителя течет вокруг.
Небольшой парафильм кусок ставится под корень. Поднимите растения и положите их на крышку. Вырезать корни около 5 до 10 миллиметров ниже гипокотиля.
Возьмите побеги обратно на маленькие кусочки парафильма. Теперь осторожно нанесите один микролитер CFDA на режущей конец корня. Старайтесь избегать загрязнения всех прото-растений.
Затем накройте крышкой, а затем оставьте их в комнате роста в течение двух часов. Метод гипокотил-щипать. Небольшая парафильмовая часть, как и предполагалось ранее, ставится под корнево-гипокотиловый узел.
Мы используем forecep, чтобы аккуратно ущипнуть гипокотил близко к корневой ткани, и осторожно применять 0,1 микролитер CFDA на ущипнул стороне и оставить растение в течение двух часов. Фотографии от девяти до 12 день после зоны окрашивания растений. Все они показывают сосудистое окрашивание как в котилендонах, так и в истинных листьях.
Только в очень редком случае, лист котилендона показал половину листа окрашивания картины. Таким образом, в основном, два метода не имеют значения в CF окрашивания картины, однако, если мы выполняем загрузку красителя во все больше и больше растений, мы находим две процедуры выдать значительную разницу сделки в эффективности. С методом корень вырезать, около 70% растений показывают флуоресцентный сигнал в стрелять.
Но эффективность может быть увеличена до 91% с помощью метода гипокотил-щипать. Мы также попробовали метод корневой щипать, но этот метод приводит к еще более низкой эффективности, это около 30% Поэтому, кажется, способ загрузки красителя не учитывает разницу окрашивания. Разница, скорее всего, заключается в местах погрузки, которые могут быть разделены симпластическим барьером.
Мы показали, как мы загружаем CFDA в корни Арабидопсиса и гипокотил. Мы использовали две несколько разные процедуры, и эти две несколько разные процедуры приводят к значительной разнице в этом движении снизу вверх. Мы предлагаем, что этот метод может помочь нам определить потенциальный симпластический барьер для корневых сигналов shootward.
