胸腺移植は、胸腺上皮細胞機能と生体内でのT細胞成熟を調べるための重要な方法である。この単純で効率的なプロトコルは、腎カプセルへのその後の移植のためにマウス18.5胸腺を分離および培養するために使用することができる。18.5胸腺移植のためのプロトコルは、他の発達段階での胸腺移植または同様の大きさの他の組織のために変更することができる。
また、この手順は非常に簡単です。このテクニックを初めて実行する際には、ケーススタンプの詳細を注意深く確認する必要があります。この手順には、視覚化を使用してより適切に説明できる詳細な操作が含まれています。
犠牲の後、胚の日18.5妊娠中のマウスを70%エタノールで拭き取り、オートクレーブ殺菌された器具を使用して、膀胱から子宮の各角までの腹部にV字型の切断を行います。メソムトリウムと子宮頸部および膣領域を切断し、氷の上に冷たいPBSを含むペトリ皿に子宮を収穫するためにはさみを使用してください。前子宮壁を一方の子宮角からもう一方の角に切り取り、エンベロープ内の胚をデシドゥアにさらし、細かいピンセットを使用してデシデュアル組織を剥がします。
臍帯を切って胚を放出し、氷の上の新しいペトリ皿に移します。最初の胸腺を収穫するには、70%アルコールで1つの胚を拭き取り、胚を新しいペトリ皿に移します。切断後、皿の中の胚をスピーヌ位置に固定し、滅菌はさみを使用して腋窩前部に沿って横胸壁を水平に切断します。
横隔膜を切って胸を開けます。胸腺は、気管の前に位置し、心臓に隣接する2つの白い葉として見える必要があります。胸腺の後ろに曲がった先端鉗子を慎重に挿入し、組織を収穫するために穏やかに引き上げます。
胸腺の完全性を確認して、2つの関節ローブが含まれていることを確認します。次に、組織と血管を整えるために、ステレオ顕微鏡を使用する前にPBSで胸腺を洗浄します。すべてのチミが採取されたら、各清潔な組織を、1ウェルあたり500マイクロリットルの培養培地を含む24ウェルプレートの個々のウェルに移します。
そして、井戸あたり1.25ミリモルの最終濃度に2'デオキシグラノシンを追加します。その後、分離したチミを細胞培養インキュベーターに8日間置く。培養の最終日には、はさみを使用して注入管部分の頭皮静脈の針を45度の角度で切断し、ヌードレシピエント動物のつまみつまみに対する応答の欠如を確認します。
右横方向の位置で手術台の上にマウスを置き、0.5%ポビドンヨウ素綿棒を使用して、体の内側から外側まで2回外科領域の皮膚を綿棒にします。メスを使用して、左腎領域の脊椎に平行に5〜9ミリメートルの皮膚切開を行い、皮下組織と筋肉を切断して腹腔を開きます。片手でピンセットを使用して、露出した腎臓の脊椎側切開端から筋肉と脂肪組織を持ち上げ、もう一方の手を使って腎臓を優しく絞り出します。
手術中に腎カプセルを湿らせた状態に保つには、腎臓の表面を生理食動物で濡らし、頭皮の針を使って、腎臓の幅を右下側の腎カプセルを緩やかに傷つけます。注入管をカプセルのニックにスライドさせ、腎臓の長い側の腎臓から約3〜4ミリメートルの腎臓カプセルに静かに取り外します。その後、注入管を引き込む。
作成されたサブカプセル空間に胸腺を埋め込むには、1つの培養胸腺を新鮮な生理食前で2回洗い、切り取った注入チューブを注射器に接続します。調製した胸腺を改変注入管にゆっくりと吸引する。そして、それが優れた極に達するまで、腎カプセルに注入チューブを静かに挿入します。
胸腺を腎カプセルに送り込むには、チューブをゆっくりと引き込み、同時にプランジャーを穏やかに落ち込ませます。アルコールランプを使用して、頭皮の針をわずかに加熱し、胸腺全体が嚢下腔内にあることを確認した後、加熱された針を使用してニックを焼灼します。焼灼された腎臓を腹腔に復元し、腹膜と筋肉を縫合糸で閉じます。
変更された中断された垂直マットレス縫合糸を使用して、少なくとも3つの結び目で皮膚切開を閉じ、ポビドンヨウ素綿棒を使用して切開を消毒する。次に、抗生物質と鎮痛の皮下注射を提供し、完全な回復まで監視と赤外線ランプの下にマウスを置きます.ここで、2つの完全なローブを含む単離胚18.5日目の胸腺が観察できる。
移植直後に、胸腺はレシピエント腎臓の先端にある腎カプセルの下で視覚化することができる。ヌードマウスレシピエント動物内で8週間の成長の後、胸腺はカプセルの下に残りますが、サイズは堅牢に増加します。T細胞は、移植された胸腺とヌードマウスレシピエントの末梢血の両方で産生される。
しかし、予想通り、T細胞は移植されていないヌード動物の末梢で検出されない。また、本代表的実験では、LacZ対立遺伝子を含む胸腺葉を移植したヌードマウスレシピエントの末梢血から採取した末梢T細胞ではLacZ遺伝子が検出されなかったことを示す。腎臓のカプセルにチューブをスライドさせるときに穏やかにしてください。
カプセルを壊さないようにしてください。そして、胸腺の配達のための十分なスペースがあることを確認してください。胸腺または末梢のT細胞集団は、フローサイトメーターを用いて分析することができる。
ここで、レシピエントの末梢組織における免疫応答は、I2dおよび免疫組織化学分析によって分析することができる。
