このプロトコルは、単一セル解像度で後続のダウンストリーム分析のために混合セルのプールから単一セルを検出および選択できるため、特に重要です。この技術の主な利点は、高純度を必要とする分析の範囲のために、個々の循環腫瘍細胞(またはCTC)を血液細胞から分離する可能性である。まず、マイクロマニピュレータソフトウェアを起動し、マイクロマニピュレータのスイッチを入れ替えます。
マイクロマニピュレータをコンピュータに接続し、[接続とデバイスの初期化] をクリックして、顕微鏡ステージでロボットアームを初期化します。保護キャビネットの外部および内部表面をエタノールで洗浄し、機械を操作するたびに保護キャビネットを閉じて、コンピュータを介してデバイスを操作することができます。ロボットアームに新しい20〜30マイクロメートルのガラスキャピラリーを取り付け、システムオイルをシステムに通してチューブ内の気泡を取り除きます。
殺菌槽1に70%エタノール、滅菌タンク2に無菌ヌクレアーゼフリー水、バッファタンクを無菌のDulbecco PBSで充填します。70%エタノールでキャピラリーを2回殺菌し、滅菌タンク1を殺菌タンク2に交換し、滅菌機能を利用してキャピラリーを水中で少なくとも3回洗浄する。マイクロマニピュレータソフトウェアで、新しい実験を開始し、自動選択モードと手動選択モードからピッキング実験の種類を選択します。
滅菌タンク、バッファータンク、および堆積トレイの位置を指定するようにデッキトレイを設定し、選択した堆積トレイ内の液体タンクの温度を摂氏4度に設定します。マイクロマニピュレータキャビネット内の顕微鏡の下に、放出されたCTC溶液を含む超低い取り付けプレートを置きます。蓋をプレートから取り出し、キャビネットを閉じます。
遠心分離機は、各ウェルの底部に分離し、プレートを選択した4°Cの1つの位置に置くように、1ウェルあたり20マイクロリットルのCTC培養培地を含む384ウェルプレートを置きます。手動でピッキングのための顕微鏡の目的と必要なすべてのチャネルの露出時間を選択します。[ウェル ナビゲーターを表示] を選択して、ピックアップ プレートのタイプを視覚化して選択します。
次に、視野の中央に細胞を含まないCTC溶液を含むウェルの中央に集荷位置を較正する。センサーを使用して、プレートの底部に毛細管を軽く触り、プレートの底面の上方に0.05ミリメートルのピックアップ位置を設定します。毛細血管の損傷を避けるために、ロボットアームを一度に10マイクロメートルずつ慎重に下げます。
セルタイプとピッキングパラメータを選択します。単一セルピッキングの場合は、手動モードを選択します。ジョイスティックを使用して、ウェル内のガラスキャピラリーをナビゲートし、ウェルボーダーから少なくとも1ミリメートル離れた関心のある単一のセルの上に毛細管を置きます。
次に、手動でパーティクルを追加し、[アクティブなパーティクルを選択]を選択して、選択を開始します。すべての細胞が摘み取られたとき、遠心分離機は各ウェルの底にある細胞を沈着させるためにプレートを沈下させる。抗上皮細胞接着分子抗体によるバイオアミノ染色は、CD45陽性事象とは正確に区別して懸濁液中の癌細胞の可視化を可能にする。
正確なCTC単離は、周囲の夾雑細胞を含まない所望の標的のみの吸引によって特徴付けられる。疑われるように、CTCクラスターは単一CTCと比較して生存率の増加を示し、インビトロ培養の56日以内に細胞コロニーを生じさせる。特に、CTCクラスターはまた、より高い増殖率を示し、したがって、より高い最終細胞数に達し、他の腫瘍細胞との直接接触が腫瘍細胞の生存率および増殖率の両方に影響を及ぼすことを示す。
乳癌患者から直接分離されたCTCの単細胞RNAシーケンシングは、単一CTC、CTCクラスター、またはCTC白血球クラスターに由来する単一細胞のT分布確率的隣接を埋め込むT分布した確率的な隣人を明らかにする。マイクロマニピュレーターの流体システム内の気泡を除去し、効率的な単一セルピッキングを確実にするためにピックアップ位置を較正するために、ガラスキャピラリーを取り付けることを忘れないでください。単一セルは、シードまたは次世代のシーケンス処理のためにさらに処理することができ、単一細胞解像度での元生体解析とCTC特性評価を可能にして、転移プロセスを調査することができます。
