このプロトコルは、げっ歯類の脳における細胞内タンパク質ユビキチン化レベルおよびプロテアソーム活性を測定し、ユビキチン-プロテアソーム活性が細胞活動、学習、または疾患に応答してどのように変化するかを被験者内で比較することを可能にする。このプロトコルは、同じげっ歯類の脳からシナプス、細胞質、核分画の収集を可能にする。損失を最小限に抑え、少量の組織と基本的な実験室設備で行うことができる。
この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるテイラー・マクファデンです。テキストプロトコルに記載されているようにげっ歯類の脳組織の収集と解剖でこの手順を開始します。使用する半球が各実験グループの抽出条件全体でカウンターバランスされていることを確認します。
マイナス80°C冷凍庫から関心領域の1つの半球を含む1.5ミリリットル遠心分離機マイクロチューブを取り除きます。メスを使用して、凍結した脳組織を2ミリリットルガラスのテフロンホモジナイザーに移す。テフロンチューブに500マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。
害虫Bを用いて、同じ組織を15ストロークで均質化し、可視量の固体材料が存在しなくなるまで。各ストロークの間に回転動作を使用します。1,000マイクロリットルピペットを使用して、均質化サンプルを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。
チューブを湿った氷の上に置き、30分間インキュベートします。チューブをマイクロ遠心分離機に入れ、摂氏4度で845倍gで10分間回転させます。完成後、慎重にピペットで上清を除去し、新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに入れ。
これは細胞質画分です。得られたペレットに50マイクロリットルの抽出バッファーを加え、ピペット処理により再中断します。ペレットを渦出させないでください。
再懸濁したペレットを含むチューブを氷の上に置き、30分間インキュベートします。その後、チューブを21で20分間遠心し、4°Cで456倍のグラムを行います。遠心分離後、ピペットで上清を慎重に取り除き、新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れる。
これが核の一部です。リシスバッファーの代わりに TEVP バッファーの 500 マイクロリットルを使用することを除いて、以前と同様に関心領域の 1 つの半球を均質化します。1,000マイクロリットルピペットを使用して、均質化されたサンプルを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。
摂氏4度で10分間1,000倍gでサンプルを遠心する。上清を集め、1,000マイクロリットルピペットを使用して新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを摂氏4度で10分間10,000倍に遠心する。
核と大きな破片を含む元のペレットを捨てます。上清を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。これは、サイトソリック分数です。
50マイクロリットルの均質化バッファーをペレットに加え、固体材料が見えなくなるまでピペッティングして再中断します。サンプルを摂氏4度で10分間20,000倍gで遠心する。上清を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。
これは、粗シナプトソーム膜画分です。アッセイを設定するには、プレートリーダーを摂氏37度に予熱し、ランを通して保持します。励起を360ナノメートルに、放出を460ナノメートルに設定します。
使用される96ウェルプレートが透明な場合は、光学の位置を底部に設定します。暗い96ウェルプレートを使用する場合は、光学の位置を上に設定します。30分ごとに2時間スキャンの時間で運動走行をプログラムします。
キットに用意されている20S 10Xアッセイバッファーを13.5ミリリットルの超純水で再構成します。100 ミリモル ATP の 14 マイクロリットルを現在の 1X バッファーに追加します。これにより、サンプル中のプロテアソーム活性が著しく向上し、アッセイの信頼性が向上します。
100マイクロリットルのDMSOでキットに提供されるAMC規格を再構成してください。AMC規格を暗い状態または低照度条件下で使用して、標準が光に敏感であるため、手順を実行します。一連の高いAMC濃度から低いAMC濃度までのAMCの標準曲線を作成します。
この曲線は、均質化されたサンプル中のプロテアソーム活性のプレートリーダー校正および分析に使用されます。キットに提供されるプロテアソームを65マイクロリットルのDMSOで再構成します。また、基板が光に敏感であるように暗い状態または低照度条件下でこのステップを行う。
次に、20Sアッセイバッファーを使用して、新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにプロテアソーム基質を1~20希釈して作成します。96ウェルプレートに目的のサンプルの正規化された量を追加します。各サンプルを重複して実行します。
必要なサンプルの量は、組織の調製に基づいて変化します。一般的に、10〜20マイクログラムは、任意の細胞内分画に対して十分である。サンプルの十分な量を80マイクロリットルに超純水で持って来なさい。
追加される量は、追加したサンプルの量によって異なります。2つの別々の井戸に、80マイクロリットルの水を単独で加えます。これらはアッセイブランクになります。
アッセイブランクを含む各ウェルに20Sアッセイバッファーの10マイクロリットルを追加します。リピータまたは自動ピペットを使用して、ウェル全体で一貫したアッセイ量を確保します。照明を消すか暗い部屋に入ります。
希釈されたAMC規格の100マイクロリットルをすべて新しい井戸に加え、各規格に対して単一のウェルを使用します。暗闇の中で、リピータまたは自動化されたピペットを使用して、サンプルとアッセイブランクを含むウェルに10マイクロリットルの希釈プロテアソーム基質を追加しますが、AMC規格は使用できません。プレートリーダーにプレートを入れ、運動走行を開始します。
ユニークなリンケージ特異的ポリウビキチン抗体と組み合わせて様々な標準的な西洋ブロッティングプロトコルを使用して、げっ歯類の脳組織から採取された異なる細胞内分画の多様なポリウビキチンタグの定量を行います。一部のユビキチンウエスタンブロット画像は、明確なバンドの列を提供し、他の人は明確な線がほとんどまたはまったくないスミアのようなパターンを生成します。イメージ化されたユビキチンウエスタンブロットの定量化については、分子標準のはしご全体を伸ばす柱の周りにボックスを描きます。
ユビキチン染色がはしご全体を通って伸びる場合は、ボックスを調整します。これはリジン48修飾に共通し、細胞内区画全体で大きく異なります。最後に、すべての辺の列を直ちに囲む背景の平均光学密度として計算される背景を差し引く。
ここに示されているのは、同じ動物の横扁桃体から採取された異なる画分におけるプロテアソーム活性の定量である。インビトロプロテアソーム活性アッセイの間、検出された相対的な蛍光単位はシナプス画分、細胞質画分、および核画分においてアッセイの最初から終わりまで増加した。プロテアソーム阻害剤β-lacは、セッション全体でRfUSが変化するのを防いだ。
同じ動物の横扁桃体におけるプロテアソーム活性において細胞内差異が認められた。核プロテアソーム活性の増加は、シナプス分画内の活性の低下に対応するコントロールに対して訓練された動物で検出された。細胞質プロテアソーム活性はベースラインに残った。
ここに示されているのは、学習後の同じ動物の横扁桃体におけるリンケージ特異的タンパク質ユビキチン化における細胞内差である。細胞質画分の減少と相関する学習後の核分率の全体的なユビキチン化の増加があった。学習後、線形ユビキチン化は核分率で増加したが、細胞質またはシナプス分画は増加しなかった。
興味深いことに、K63ユビキチン化は、シナプス分率の減少と相関する学習後の核分率で増加した。一方、K48ユニキチン化は、学習後の核および細胞質画分では増加したが、シナプス画分では増加しなかった。このプロトコルは、同じ動物内の他のタンパク質の細胞内分布および機能を理解するためにも使用することができる。
