実質的なニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン数の推定は、パーキンソン病研究における重要な結果尺度である。このプロトコルは、ニューロン数の推定に必要な作業負荷を大幅に短縮します。この方法は、ドーパミン作動性ニューロン数の変化を検出するための時間効率の良い正確なプロセスを提供し、細胞生存に対する介入の影響を決定するのに適している。
この方法は、従来のステレオロジー方法よりもコストと時間の利点を維持しながら、異なる脳領域のニューロンの正確なカウントを提供するために簡単に適応することができます。IHC画像をキャプチャするには、ソフトウェアを10倍倍で共焦点顕微鏡に結合します。ピンホールを1.5の面積単位に開き、合計1.5マイクロメートルの広い平面を捕獲し、脳の注入された側面に焦点を当てます。
取得タブで、タイル スキャン イメージング オプションをオンにし、寸法を 10 ずつ 4 に設定します。取得モードパネルでは、タイルスキャン画像間のステッチマークを避けるために、ズームを1.1に設定します。フレームサイズを1024 x 1024ピクセルに設定し、平均を2に設定して、高品質の画像取得を確実にします。
チャンネルパネルでは、Alexa 488にトラック1を設定し、Alexa 555に2をトラックします。ステージにスライドをロードし、強いTH染色のセクションを選択します。取得パネルでライブをクリックします。
チャンネルパネルで、レーザー強度とゲインを信号を最大化し、バックグラウンドノイズを制限するレベルに設定します。範囲インジケータを使用して、シグナルが過度に露出しないようにします。複数のスライドでこの操作を繰り返します。
取得タブで、ポジションボックスをオンにします。イメージングを開始するには、アイピースを使用し、正のTH染色を示す最初のセクションを選択します。次に、対象のポイントにフォーカスを設定し、ステージをセクションの中線に移動します。
これにより、X、Y、Z 軸の位置が保存され、セクション全体をキャプチャするタイル スキャンがイメージ化されます。この手順は、挿入されていないサイトを含む他のすべてのスライドに対して繰り返します。適切なソフトウェアを使用して画像ファイルを分離し、それらを自動画像解析ソフトウェアにインポートします。
ペン注釈ツールを選択して、実質的なニグラパースコンプッサの周りに注釈を描画することで、対象領域を定義します。[解析] タブに移動し、ドロップダウン分析メニューからリアルタイムチューニングを選択します。これにより、断面イメージ上に別のウィンドウが開き、解析パラメータをリアルタイムで変更できます。
解析の倍率セクションで、適切な画像ズームを選択します。細胞検出部の下でTH染色に使用する色素として核染料を選択します。タイムチューニングウィンドウを注意深く見ながら、核コントラストの閾値、最小核強度、核セグメンテーションの攻撃性、核サイズの設定を調整します。
このプロセスを複数のサンプルで繰り返します。適切な数の画像をサンプリングし、リアルタイムチューニングを調整したら、設定アクションドロップダウンメニューの分析設定を保存します。分析するすべての画像を選択し、分析をクリックします。
保存した解析設定を選択し、解析ウィンドウの領域で[アノテーション レイヤー]ボックスをオンにして、レイヤー 1 をオンにして[解析]をクリックします。オブジェクト分析データをエクスポートするオプションを選択して、すべてのセクションのサマリー分析データをエクスポートします。このデータセットは、毒素または治療に応答して細胞サイズの変化を調べるために使用することができる。
アデノ関連ウイルスまたはAAV注射の6週間後、ラット脳内の実質的なニグラに変異体A53T αシヌクレインを発現するAAVの定位注射はドーパミン作動性ニューロンの密度の有意な減少をもたらした。AAV-A35Tを注射したラットの実質的なニグラで2乗当たりのTH陽性ニューロンの数は、AAV空のベクターを注射したラットのそれと比較して有意に減少した。同様の観察は、公平なステレロジーを用いて行われた。
このプロトコルを試みるとき、ソフトウェアは、それが訓練されているのと同じくらい有用であることを覚えておいてください。したがって、単一のセルが単一のセルとして識別されるように、時間と注意を払う必要があります。このソフトウェアは、α-シヌクレインなどの興味のある他のタンパク質の蛍光強度を測定し、治療がタンパク質レベルを調節できるかどうかを判断するように調整することができます。
この技術は、ドーパミン作動性ニューロン密度に対する複数の潜在的な治療の効果をテストするときの効率を高くすることができました.
