このプロトコルは、E3リガーゼによる特定の基質のユビキチル化を評価することを可能にする。我々は、リガーゼ-基質相互作用の特性評価が、細胞におけるそれらの機能を理解するために重要であることを知っています。この技術は、高価な試薬や洗練された機器を必要としません。
プラスミドと目的の遺伝子のコーディング、細胞溶解物による免疫沈降アッセイの開発、および基質ユビキチル化を検出するためのウェスタンブロットが必要です。癌や神経学的障害のようないくつかのヒト疾患は、E3リガーゼの調節不全と関連している。したがって、特定のE3リガーゼによる基質ユビキチル化の同定は、これらの疾患の治療または診断に役立つ可能性がある。
手順のデモンストレーションは、バレンタイン・スパニョールによるものです。開始するには、10%ウシ胎児血清および100単位ペニシリン、100マイクログラムのストレプトマイシン、および1ミリリットルあたり0.292ミリグラムのL-グルタミンを添加したダルベッコの改変イーグルス培地中で、HEK293T細胞株を80〜90%コンフルエントに成長させる。次いで、この培養物を5%二酸化炭素で加湿した細胞培養インキュベーター内で摂氏37度でインキュベートする。
血清学的ピペットを用いて培養皿から培地を吸引して細胞を継代し、滅菌した1X PBSの1ミリリットルで1回洗浄する。次に、1ミリリットルのトリプシンエチレンジアミン四酢酸溶液を加えて細胞を剥離し、摂氏37度で5分間インキュベートした後、血清学的ピペットを用いてこれらの細胞を2ミリリットルの成長培地に再懸濁する。細胞懸濁液を新鮮で清潔な15ミリリットルチューブに移し、室温で5分間500倍Gで遠心分離する。
次いで、上清を穏やかに除去し、細胞ペレットを上下にピペッティングすることによって3ミリリットルの成長培地に再懸濁し、均質な細胞懸濁液を得た。次いで、この細胞懸濁液1ミリリットルを、9ミリリットルの増殖培地を含む100ミリメートルTC処理培養皿に移す。トランスフェクションの前に、細胞に汚染がなく、一過性トランスフェクションの適切なコンフルエントにあるかどうかを認証します。
各トランスフェクションサンプルについて、各プラスミドの3マイクログラムを100マイクロリットルのOpti-MEM 1還元血清培地に補充せずに希釈し、溶液を上下にピペッティングして穏やかに混合することにより、DNA-ポリエチレンイミン複合体を調製する。次に、DNA-ポリエチレンイミンを室温で解凍し、DNA1マイクログラムあたり3マイクロリットルのDNA-ポリエチレンイミンの割合で溶液に添加する。溶液を上下にピペッティングして均質化する。
次いで、それを室温で15分間インキュベートして、DNA-ポリエチレンイミン複合体の形成を可能にする。DNA−ポリエチレンイミン複合体の全量を細胞培養物を含む各ディッシュに加え、プレートを前後に揺らして穏やかに混合する。次いで、これらの細胞を加湿細胞培養インキュベーター内で摂氏37度でインキュベートする。
インキュベーション後および細胞溶解の6時間前に、トランスフェクトされた細胞を10マイクロモルのプロテアソーム阻害剤MG132で処理し、加湿細胞培養インキュベーター内で細胞をインキュベートする。次に、血清学的ピペットを用いて各培養皿から培地を吸引し、1ミリリットルの1X PBSで細胞を1回洗浄する。次いで、1ミリリットルのトリプシンを加えて細胞を剥離し、ディッシュを摂氏37度で5分間インキュベートする。
細胞を1ミリリットルの成長培地に再懸濁し、細胞懸濁液を新鮮で清潔な2ミリリットルのマイクロチューブに移し、室温で5分間500倍Gで遠心分離する。遠心分離が終了したら、上清を慎重に注ぎ出して上清を除去し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを添加した200マイクロリットルの氷冷MP40溶解バッファーに細胞ペレットを静かに再懸濁します。次に、この溶液を清潔な1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。
この細胞ライセートを氷上で30分間インキュベートし、インキュベーション後、細胞ライセートを摂氏4度で20分間、16,900倍Gで遠心分離する。一方、アガロース抗HAビーズを氷冷MP40溶解バッファーで平衡化する。各サンプルに15マイクロリットルのアガロース抗HAビーズを使用してください。
ビーズを200マイクロリットルのMP40溶解バッファーで洗浄し、3, 000倍のGのマイクロ遠心管で摂氏4度で1分間パルスします。次に、上清をピペットで慎重に吸引して捨て、このプロセスを3回繰り返します。その後、ビーズを氷上で平衡化してから使用してください。
細胞溶解物を遠心分離した後、上清を回収し、ブラッドフォード法を用いて溶解物全体のタンパク質含有量を定量し、免疫沈降に供する各サンプルが等量のタンパク質を提示することを確認する。UXT-V2-HAがアガロース抗HAビーズに結合することを可能にする4°Cの回転インキュベーター内で穏やかに回転させながら、平衡化されたアガロース抗HAビーズと共に細胞溶解物の必要量を4時間インキュベートする。アガロース抗HAビーズを、微量遠心管中で3, 000倍Gで4°Cで1分間脈動させて回収する。
慎重に吸引し、上清を捨てる。ビーズを氷冷MP40細胞溶解バッファーで3回、氷冷FLAG HAバッファーで2回洗浄します。最終洗浄後、ピペットを使用してすべての上清を慎重に取り除き、FLAG HAバッファーで希釈したHAペプチド1ミリリットルあたり300マイクログラムでポリユビキチル化タンパク質を溶出します。
アガロース抗HAビーズをHAペプチドと共に、ロッキングシェーカープラットフォーム中で摂氏4度で1時間インキュベートする。次に、ビーズを3,000倍Gで4°Cで2分間スピンダウンし、ポリユビキチン化タンパク質を含む上清を慎重に除去します。必要に応じて、溶離液をマイナス20°Cの新鮮で清潔なマイクロチューブに保管してください。
溶離液および細胞溶解物を10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブロッティングで解決する。湿式転写ウエスタンブロッティングを行うには、ろ紙、ゲルメンブレンろ紙からなる転写サンドイッチにゲルを入れ、パッドでクッションし、支持格子で一緒に押します。次に、このシステムを、ステンレス鋼または白金線電極の間に移送バッファーを充填したタンクに垂直に置きます。
転送は、湿式転写バッファー中で150ボルトで90分間行われます。最後に、抗myc抗体を用いてイムノブロット膜をプローブする。細胞内のF-boxタンパク質7によって媒介されるUXT-V2-HAの特異的なポリユビキチル化を、抗myc抗体による抗HA免疫沈降から溶離液をプロービングした後に観察し、これは基質にコンジュゲートしたmyc-ubを検出する。
ポリユビキチル化基質に対する抗mycの特異性をレーン1および2で可視化し、UXT-V2-HAプラスミドの非存在下で細胞をF-boxタンパク質7およびmyc-ubと同時トランスフェクトした場合、ポリユビキチル化タンパク質のスミアは検出されなかった。さらに、myc-ubプラスミドを含まないF-boxタンパク質7とUXT-V2-HAの組み合わせでは、タンパク質ポリユビキチン化に対応するスミアが可視化されなかった。活性SCFをアセンブルできない空ベクター野生型F-boxタンパク質7またはF-boxタンパク質7変異体をUXT-V2-HAおよびmyc-ubと組み合わせてトランステクトした場合、野生型F-boxタンパク質7についてのみポリユビキチル化UXT-V2の強いスミアシグナルが観察され、対照と比較してUXT-V2がSCF F-boxタンパク質7複合体および細胞によってポリユビキチル化されたことが示唆された。
平衡化ビーズとの細胞溶解物のインキュベーションおよび免疫沈降タンパク質の溶出を含む単沈降ステップは、このプロトコルの目的を達成するために不可欠です。この手順の後、E3リガーゼによる基質ユビキチル化の特異性を確認するために、インビトロユビキチル化アッセイを実施すべきである。
