私たちのプロトコルはユーザーフレンドリーです。この技術を用いると、誰でも簡単に血液から成分を単離することができる。汚染を最小限に抑え、材料を正確に分離することができます。
自動化とこのプロトコルの確立により、研究者は高純度のがん関連物質を簡単に入手でき、さまざまな下流の研究に役立ちます。特に、エンドユーザーの研究に重要な利点を提供することが期待されています。彼らの手順を実演するのは、がんゲノミクス研究所の上級研究員兼アシスタントマネージャーであるJay Jeongです。
まず、機器のタッチスクリーンパネルでカートリッジタイプを選択して、LBx 1カートリッジをロードします。矢印ボタンを押して、サンプル数を変更します。次に、機器のドアを開き、使用するすべてのカートリッジをカートリッジホルダーの番号順に挿入します。
合計 4 つのカートリッジの場合は、カートリッジホルダーの空きスペースにダミーカートリッジを置きます。サポートホイールを使用してカートリッジを取り付け、ロックナットを締めて固定します。ドアを閉め、タッチパッド画面の実行ボタンを押します。
機器はカートリッジのバルブを閉じますが、これには約30秒かかります。メッセージに従ってドアを開けます。サポートホイールを取り外し、バルブクローズカートリッジをカートリッジホルダーから取り外します。
血清学的ピペットを使用して、最大10ミリリットルの全血サンプルをピペットでピペットします。ピペットチップをカートリッジのサンプル入口の奥深くに挿入し、全血サンプルをゆっくりと注入します。カートリッジを機器に挿入した後、機器のドアを閉じてOKボタンを押します。
血漿とバフィーコートは全血から自動的に分離され、約30分かかります。プラズマとバフィーコートが分離すると、アラーム音を伴うメッセージが画面に表示されます。ドアを開けるか、停止ボタンを押してアラームを停止します。
戸を開けて下さい。カートリッジを取り外し、テーブルに置きます。1ミリリットルのピペットチップを使用して、血漿出口から3ミリリットルの血漿を回収します。
次に、1ミリリットルのピペットチップを使用して、バフィーコート出口から3ミリリットルのバフィーコートを回収します。次に、機器のタッチスクリーンパネルでカートリッジ名を選択して、LBx 2カートリッジをロードします。矢印ボタンを押してサンプル数を変更し、LBx 1カートリッジと同じ手順に従ってカートリッジをカートリッジホルダーに挿入します。
カートリッジを挿入してドアを閉めた後、タッチパッド画面の実行ボタンを押します。前に示した手順に従って、バルブクローズカートリッジをカートリッジホルダーから取り外し、テーブルに置きます。密度勾配溶液を血清学的ピペットを用いてピペットする。
ピペットチップをカートリッジの入口の奥深くに挿入し、溶液をゆっくりと注入します。次に、全血サンプルをピペットで固定し、サンプルインレットにゆっくりと注入します。カートリッジを挿入して固定したら、ドアを閉じてOKボタンを押します。
血漿とPBMCが全血から自動的に分離されると、アラーム音を伴うメッセージが表示されます。ドアを開けてカートリッジを取り外します。1ミリリットルのピペットチップを使用して血漿出口から3ミリリットルの血漿を回収し、次にPBMC出口から3ミリリットルのPBMCを回収します。
同様に、FAST-autoカートリッジの場合、バルブクローズカートリッジをカートリッジホルダーから取り外した後、6ミリリットルのPBS溶液をカートリッジのPBSインレットに注入します。次いで、LBx1から得られた全血またはバフィーコート、またはLBx2から得られたPBMC試料3ミリリットルをピペットし、カートリッジのサンプル入口にサンプルをゆっくりと注入する。カートリッジを挿入して固定したら、ドアを閉じてOKボタンを押します。
CTC の自動エンリッチメントが完了したら、アラームを停止します。カートリッジを取り外し、バックプレートリムーバー(BPR)をカートリッジ前面の4つの穴に挿入します。両手の親指で紺色の翼を押してから、カチッと音がするまで水色の体を押します。
カートリッジ本体を持ち上げて慎重に取り外します。非常に穏やかに、ピンセットを使用してフィルターメンブレンの端を持ち上げ、メンブレンを核酸調製用の1.5ミリリットルのチューブに入れるか、染色用のスライドガラスの上に置きます。必要に応じて、1ミリリットルのピペットチップを使用して、ろ過した血液を血液出口に回収します。
抽出したcfDNAをバイオアナライザーを用いて評価し、cfDNAスクリーンテープを電子ラダーと併用した。緑色の線は、はしごとサンプルの位置合わせに使用されました。三角形のマークはDNAバンドを示します。
ほとんどのcfDNAは166塩基対の長さを持ち、一部は整数倍の長さで存在します。通常、cfDNAの濃度は50〜700塩基対のサイズまで測定されます。ミリリットルあたり8.47ナノグラム、ミリリットルあたり5.2ナノグラムなど、個々のサンプルから得られた量には違いがありますが、cfDNA抽出の結果は、すべての場合において濃度とサイズ分布の両方で良好でした。
これらの結果は、LBx 1法がcfDNAを含む血漿を正確に分離することを示している。FAST-autoでは、膜を除去し、蛍光抗体で染色してCTCおよび白血球を検出した。染色した膜をスライドガラス上に置き、蛍光顕微鏡下で観察した。
膜染色後、細胞はDAPIまたは核陽性のシグナルを青色で示し、EpCAMおよびCKまたはCTC陽性は緑色で強調表示され、CD45またはWBC陽性は赤色で強調表示されます。膜を除去することは難しくありません。ただし、CTCの紛失や汚染には注意が必要です。
全血、PBMC、バフィーコートがすべて利用可能です。代わりに、ボリューム全体を設定する必要があります。テストが必要になりますが、他の液体も使用できます。
この技術は病院で直接操作することができ、物質を迅速に入手することができます。
