Este protocolo permite a detecção de mutações associadas ao tumor e atualmente complementa procedimentos cirúrgicos invasivos. Outra força é a capacidade de usar este protocolo para monitorar a carga de mutação tumoral horas extras. A técnica permite a genotipagem tumoral sem exigir biópsia real de tecido cirúrgico, o que é particularmente útil para tumores em locais desafiadores, como o tronco cerebral com acesso restrito ao tecido.
Na ausência de biópsia repetida, dados moleculares longitudinais não estão disponíveis para complementar a ressonância magnética. O monitoramento digital do PCR facilita um suplemento molecular ao diagnóstico, possibilitando um processo de tomada de decisão de tratamento mais informado. Métodos semelhantes podem ser usados para detectar a expressão de genes em determinado sistema, com sondas convencionais fluo-4 e ligadas a quencher, mas com uma sensibilidade maior do que com o PCR quantitativo.
Antes de iniciar o procedimento de PCR digital gotícula, limpe o espaço do banco e os equipamentos com 10% de alvejante e 70% de etanol e suavemente vórtice e centrifufique brevemente todos os reagentes, exceto o óleo estabilizador da gotícula. Confirme que o cilindro de gás nitrogênio comprimido está ligado ao instrumento gerador de gotículas e que o tanque do cilindro é fixado em 90 libras por polegada quadrada. E 38 microliters de mistura de reação PCR digital diretamente na parte inferior de cada poço de uma tira de tubo PCR de oito poços, removendo quaisquer bolhas com uma ponta de pipeta limpa.
Adicione 12 microliters de amostra de DNA pré-amplificada em triplicado aos poços apropriados da tira do tubo. Pipeta suavemente o volume total 10 vezes para misturar a mistura de reação com a amostra de DNA e pipeta o volume total de cada poço para os canais A correspondentes através de H de um chip de instrumento gerador de gotícula. Insira uma nova tira de tubo PCR no instrumento gerador de gotículas e escaneie o chip de instrumento gerador de gotícula no software no computador de instrumento.
Em seguida, clique em Iniciar a Execução para iniciar amostras dropletizing. Quando a dropletização estiver completa, remova a tira do tubo PCR e aplique tampas de tiras de tubo. Transfira a tira do tubo para um cicloviário térmico e equilibre o tubo com outra tira de tubo contendo 80 microliters de água por poço.
Em seguida, execute o cicloviário térmico sob as condições de ciclismo térmico apropriadas. Substitua as tampas de tiras por tampas de alta velocidade. Quando o ciclismo térmico estiver completo, transfira a tira do tubo para o instrumento de quantificação, clique em Configurar uma Run no software de instrumento e coloque a tira do tubo no instrumento de quantificação.
Coloque o escudo metálico em cima de um novo chip de instrumento de quantificação, escaneie o iD do chip no instrumento e insira o chip na máquina. Feche a tampa do instrumento. No software do computador, digite um nome para a execução do PCR digital e para cada um dos oito canais, selecione Modo Rápido e clique em Iniciar a quantificação.
Para analisar os dados espectrais brutos, inicie o software de analista e abra os arquivos fcs. Na exibição da análise, selecione intacta. Em exibição de amostra, clique nas caixas ao lado de cada uma das oito amostras.
O software irá traçar os sinais para os alelos mutantes e do tipo selvagem ao longo do eixo x e y, respectivamente. Use a função matricial calculada para solicitar a compensação espectral nas gotículas intactas, de acordo com os instrutores do fabricante e ajuste as configurações do eixo em opções de eixo. Defina o eixo x para um mínimo de zero e um máximo de 30.000 e o eixo y para um mínimo de menos 5.000 e um máximo de 10.000.
Quando os clusters de gotículas tiverem sido identificados, ajuste o eixo para reduzir o espaço vazio no gráfico. Selecione a amostra correspondente ao DNA genômico do tecido tumoral de controle positivo para definir os portões mutantes e selvagens negativos, garantindo que os aglomerados sejam distintos e facilmente identificados. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione Aplicar todas as configurações em amostras selecionadas para aplicar as configurações do portão para o controle positivo em todas as amostras.
Sob a exibição gráfica, clique em várias amostras para visualizar os plots de todas as amostras selecionadas e exporte a imagem como um arquivo tif. Em seguida, em Workspace, selecione Análise de exportação e salve o arquivo de dados analisado como um arquivo csv. Aqui, resultados representativos para uma detecção bem sucedida de uma mutação em um plasma pré-amplificado e DNA líquido cerebrospinal livre de duas crianças com gliomas de linha média difusa são mostrados.
Neste experimento, uma clara separação entre os aglomerados mutantes e selvagens pode ser observada ao longo do eixo x e y, respectivamente. Aglomerados robustos do tipo selvagem indicam que a extração de DNA livre de células foi bem sucedida porque o DNA do modelo está presente. Para esses pacientes, os aglomerados mutantes mostram uma frequência alínica de mutação de 1,6 e 39,32% para as amostras de plasma e fluido cefalorraquidiano, respectivamente, de acordo com o estado de mutação tumoral confirmado pela análise genômica do tecido tumoral biopsiado.
O controle negativo, por outro lado, mostra zero gotículas mutantes e zero tipo selvagem indicando que não houve contaminação da mistura de reação pcr. O DNA genômico do tecido tumoral de controle positivo mostra a mutação sendo detectada na frequência allelic esperada para a amostra de tumor em particular selecionada. A ausência de detecção de mutação dentro do plasma pode não ser necessária significa que um paciente é do tipo selvagem para a mutação de interesse, pois falsos negativos ocorrem.
Por exemplo, neste paciente, embora a mutação de interesse não tenha sido detectada, o estado de mutação foi confirmado pela análise genômica do tecido tumoral. A PCR é uma técnica muito sensível que exige uma descontaminação frequente da área de trabalho e equipamentos para evitar a aquisição de dados falsos positivos.
