이 프로토콜은 종양 관련 돌연변이의 검출을 가능하게 하고 현재 침략적인 외과 적 절차를 칭찬합니다. 또 다른 강도는 종양 돌연변이 부하 초과를 모니터링하기 위해이 프로토콜을 사용하는 기능입니다. 이 기술은 제한된 조직 접근을 가진 두뇌 줄기 같이 도전적인 위치에 있는 종양에 특히 도움이되는 실제 외과 조직 생검을 요구하지 않고 종양 지평을 가능하게 합니다.
반복 생검의 부재에서, 세로 분자 데이터는 MRI를 칭찬하기 위하여 유효하지 않습니다. 디지털 PCR 모니터링은 진단에 대한 분자 기반 보충제를 용이하게 하여 보다 정보에 입각한 치료 의사 결정 과정을 가능하게 합니다. 유사한 방법은 종래의 플루오-4 및 담관-연결된 프로브를 사용하여 특정 시스템에서 유전자의 발현을 검출하는 데 사용될 수 있지만 정량적 PCR보다 더 높은 감도를 갖는다.
물방울 디지털 PCR 절차를 시작하기 전에 벤치 공간과 장비를 10 % 표백제와 70 %에탄올로 청소하고 부드럽게 소용돌이및 액적 안정화 오일을 제외한 모든 시약을 간략하게 원심합니다. 압축 질소 가스 실린더가 액적 생성 기기에 부착되어 있고 실린더 탱크가 평방 인치당 90 파운드로 설정되어 있는지 확인합니다. 그리고 디지털 PCR 반응 혼합물의 38 마이크로리터는 깨끗한 파이펫 팁으로 거품을 제거하여 8 개의 잘 PCR 튜브 스트립의 각 우물의 바닥에 직접 들어갑니다.
튜브 스트립의 적절한 우물에 삼중 항에 미리 증폭 된 DNA 샘플 12 마이크로 리터를 추가합니다. 전체 부피를 10회 부드럽게 피펫하여 반응 혼합물을 DNA 샘플과 파이펫을 혼합하여 각 웰의 전체 부피를 해당 A채널로 혼합하여 물방울 생성 기기 칩의 H 채널을 통해서. 새로운 PCR 튜브 스트립을 물방울 생성 기기에 삽입하고 계측기 컴퓨터의 소프트웨어에 계측기 칩 ID를 생성하는 물방울을 스캔합니다.
그런 다음 실행 시작을 클릭하여 샘플 을 삭제하기 시작합니다. 액적 제거가 완료되면 PCR 튜브 스트립을 제거하고 튜브 스트립 캡을 적용합니다. 튜브 스트립을 열 사이클러로 옮기고 튜브와 우물당 80 마이크로리터가 들어있는 다른 튜브 스트립의 균형을 유지합니다.
그런 다음 적절한 열 순환 조건에서 열 순환을 실행합니다. 스트립 캡을 고속 캡으로 교체합니다. 열 순환이 완료되면 튜브 스트립을 정량화 기기로 옮기고 계측기 소프트웨어에서 실행 설정을 클릭하고 튜브 스트립을 정량화 기기에 배치합니다.
새로운 정량화 계기 칩 위에 금속 방패를 놓고 칩 ID를 기기에 스캔하고 칩을 기계에 삽입합니다. 악기의 뚜껑을 닫습니다. 컴퓨터 소프트웨어에서 디지털 PCR 실행 및 8개 채널 각각의 이름을 입력한 다음 빠른 모드를 선택하고 시작을 클릭하여 정량화를 시작합니다.
원시 스펙트럼 데이터를 분석하려면 분석가 소프트웨어를 실행하고 FCs 파일을 엽니다. 분석 보기에서 그대로 선택합니다. 샘플 보기에서 8개의 샘플 각각 옆에 있는 상자를 클릭합니다.
이 소프트웨어는 각각 x및 y 축을 따라 돌연변이 및 야생 유형 본선에 대한 신호를 플롯합니다. 계산된 매트릭스 함수를 사용하여 제조업체 강사에 따라 그대로 물방울에 스펙트럼 보정을 적용하고 축 옵션에서 축 설정을 조정합니다. x 축을 최소 0으로 설정하고 최대 30, 000 및 y 축을 최소 5, 000 및 최대 10, 000으로 설정합니다.
액적 클러스터가 식별되면 축을 조정하여 그래프의 빈 공간을 줄입니다. 양성 조절 종양 조직 유전체 DNA에 대응하는 샘플을 선택하여 음극 돌연변이 및 야생 형 게이트를 설정하여 클러스터가 구별되고 쉽게 식별되도록 합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 을 클릭하고 선택한 샘플에 대한 모든 설정 적용을 선택하여 모든 샘플에 긍정적 인 컨트롤의 게이트 설정을 적용합니다.
그래픽 뷰에서 여러 샘플을 클릭하여 선택한 모든 샘플에 대한 플롯을 보고 이미지를 tif 파일로 내보냅니다. 그런 다음 작업 영역 에서 내보내기 분석을 선택하고 분석된 데이터 파일을 csv 파일로 저장합니다. 여기서, 확산성 중음질증을 가진 두 어린이로부터 미리 증폭된 혈장 및 뇌척수액 세포 에서 돌연변이의 성공적인 검출을 위한 대표적인 결과가 나타난다.
본 실험에서는, 돌연변이체와 야생형 클러스터 사이의 명확한 분리는 각각 x 및 y 축을 따라 관찰될 수 있다. 견고한 야생 형 클러스터는 템플릿 DNA가 존재하기 때문에 세포 없는 DNA 추출이 성공했다는 것을 나타냅니다. 이들 환자의 경우, 돌연변이 클러스터는 생검 종양 조직의 유전체 분석에 의해 확인된 바와 같이 종양 돌연변이 상태에 따라 각각 혈장 및 뇌척수액 샘플에 대해 1.6 및 39.32%의 돌연변이 알꼴 주파수를 나타낸다.
반면에 음의 조절은 PCR 반응 혼합물의 오염이 없음을 나타내는 0 돌연변이 및 제로 야생 형 물방울을 나타낸다. 양성 조절 종양 조직 유전체 DNA는 선택된 특정 종양 샘플에 대한 예상 된 알꼴 주파수에서 검출되는 돌연변이를 나타낸다. 플라즈마 내의 돌연변이 검출이 없다는 것은 환자가 거짓 네거티브가 발생하기 때문에 관심의 돌연변이를 위한 야생 타입이라는 것을 의미할 필요는 없습니다.
예를 들어, 이 환자에서는 관심있는 돌연변이가 발견되지 않았지만, 종양 조직의 게놈 분석에 의해 돌연변이 상태를 확인하였다. PCR은 거짓 긍정 데이터의 수집을 피하기 위해 작업 영역및 장비의 빈번한 오염 제거를 요구하는 매우 민감한 기술입니다.
