腸間葉系を単離するための当社のプロトコルは、テロサイトの高収率をもたらします。この方法は、恒常性および疾患におけるテロサイトを含む細胞間相互作用を研究するための最初のプラットフォームを提供します。テロサイトは、利用可能な組織解離プロトコルに感受性のあるユニークな細胞です。
したがって、この技術の主な利点は、濃縮された生存可能なテロサイトを含む間葉の単離である。テロサイトを含む間葉系は、組織化された成長に必要なシグナル伝達分子および成長因子の源として、ex vivoで働き得る。はじめに、安楽死させたマウスから分離した腸を、冷たい滅菌PBSを含むペトリ皿で洗います。
腸をペトリ皿に入れます。そして、ボールチップハサミを使用して、腸管を縦方向に開き、糞便を洗い流します。腸を新鮮で冷たいPBSを含む新しい皿に移します。
もう一度腸を洗った後、小腸を1センチメートルの長さのセグメントに切断し、8ミリリットルのPBSで満たされた15ミリリットルの円錐形のチューブに移します。チューブを1秒間に1〜2サイクルで1分間手動で振ってください。溶液をペトリ皿に注ぎます。
そして、鉗子を使用して、セグメントを20ミリリットルの溶液で満たされた50ミリリットルの円錐形のチューブに移します A.チューブを摂氏37度のオービタルシェーカーインキュベーターに20分間入れます。インキュベーション後、チューブを毎秒4〜5サイクルで1分間手で激しく振って上皮を解離させます。この手順をもう一度繰り返します。
前に示したように断片を切断して洗浄した後、それらを10ミリリットルの滅菌PBSで満たされた新しい50ミリリットルのチューブに移し、1秒間に1〜2サイクルでチューブを1分間反転させます。溶液をペトリ皿に注ぎます。セグメントを10ミリリットルの滅菌PBSで満たされた新しい15ミリリットルのチューブに移し、毎秒1〜2サイクルで2分間穏やかに上下に傾けます。
バイオセーフティキャビネットの下で、鉗子を使用してセグメントを滅菌ラボワイプに置き、乾燥させます。乾いたら、セグメントをさらに細かく切ります。鉗子を使用して切断片を、ウェルあたり4ミリリットルの予熱消化溶液で満たされた6ウェルプレートに移します。
プレートを摂氏37度で50分間インキュベートし、20分ごとに手動でプレートを静かに振ってください。次に、パスツールピペットを使用して、4ミリリットルのDMEMで満たされた15ミリリットルの円錐管にピースを移します。チューブを毎秒4〜5サイクルで1分間手動で振って、単一の細胞懸濁液を取得します。
懸濁液を100マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に濾過する。ろ液を700gで摂氏4度で5分間遠心分離します。吸引により上清を廃棄し、細胞ペレットを5ミリリットルの2%FBS/PBSに再懸濁します。
懸濁液を700gで5分間でもう一度遠心分離した後、上清を捨て、細胞ペレットを12ミリリットルの培養液に再懸濁した。最後に、細胞懸濁液を6ウェルプレートに播種します。間葉系解離後、テロサイトは細胞特性を失い、丸い細胞形態を示し、初日には翌日に比べてGFP陽性細胞の数が少なくなります。
数日後、テロサイトは短い細胞プロセスを伴う小さな伸張された細胞形態を示します。播種の7〜10日後、テロサイトは細胞特性を取り戻し、長い細胞質プロセスを伴う大きく伸びた細胞形態を示します。フローサイトメトリーは細胞組成を明らかにします。
全体として、単離された細胞の69%がDAPI染色に基づいて生存可能であった。そしてこれらのうち、60.9%は上皮汚染と免疫細胞および内皮細胞を表しています。テロサイト画分はそれぞれ100kおよび70kFSCおよびSSCを超えて散在し、ゲート間葉のほぼ10%を占めた。
FACS分析により、テロサイトのサブセットはCD201およびGP38への陽性染色によって定義できることが明らかになりました。これらのマーカーを用いた1日培養間葉の免疫染色は、細胞が細胞特性を示さないにもかかわらず、これらの分子マーカーの発現を示した。この手順により、間質細胞の生存可能な単一細胞懸濁液が得られ、2D培養だけでなく、オルガノイドとの3D共培養やバイオプリンティングなどの他のアプリケーションに使用できます。
