このプロトコルは、単一の抽出方法と単一のLC-MS法を使用してサッカロミセス・セレビシエの10種類の脂質クラスを定量化するための正確で再現可能な方法を提供します。この方法により、異なる化学的および物理的特性を有するイソバリックおよび異性体脂質種の検出および定量化が可能になる。サッカロミセス・セレビシエ培養の場合、最初に滅菌YNB培地を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに5mlの無菌20%グルコースストック溶液を2%グルコースの最終濃度に加える。
次いで、滅菌ピペットを使用して、50倍から7番目の酵母細胞を含む一晩の酵母培養物の体積を各フラスコに移し、フラスコを30°Cで少なくとも24時間培養し、1分間に200回転で回転揺れをします。脂質抽出のために、培養のミリリットル当たりの酵母細胞の総数を決定し、15ml遠心管に7番目の細胞に5回10回を移す。氷冷ナノ純水を加え、総体積を最大15mlにし、遠心分離によって細胞を採取します。
2番目の遠心分離のために15mlの氷冷イソトニック重炭酸アンモニウムバッファーで酵母ペレットを再懸濁し、1.5mlの新鮮な氷冷アンモニウム重炭酸塩溶液中のペレットを再懸濁します。遠心分離の終わりに、抽出するまで80°Cでペレットを保存します。脂質抽出を開始するには、氷冷ナノ純水の200マイクロリットルで細胞を再懸濁する前に、氷上の細胞ペレットを解凍します。
ヒュームフードで、セル懸濁液を15mlに移し、高強度ガラス、ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付きトップ遠心管をスクリューし、2:1クロロホルムメタノールで調製した内部脂質標準混合物の25マイクロリットルを加える。100マイクロモル酸洗浄ガラスビーズと600マイクロリットルの100マイクロモル酸は、チューブに17:1クロロホルムメタノールの。室温で5分間高速でチューブをボルテックスし、細胞を破壊する。
続いて、脂質抽出を容易にするために室温で低速で1時間渦を起こさせる。抽出の終わりに、サンプルを氷上で15分間インキュベートし、タンパク質の沈殿および水相と有機相の分離を促進する。インキュベーションの終わりに、サンプルを遠心分離して上側の水相を下側有機相から分離し、ヒュームフードでは、ホウケイ酸ガラスピペットを使用して、ポリテトラフルオロエチレン裏面チューブを新しい15ml高強度ガラススクリュー上遠心管に移します。
窒素ガスの流れの下に低い有機相を置き、ヒュームフードに残りの上部水相に2:1クロロホルムメタノール混合物の300マイクロリットルを加えます。ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールおよびカーディオ-脂質抽出ボルテックスを室温で5分間激しく回転させ、試料を遠心分離する前にチューブを促進する。ホウケイ酸ガラスピペットを使用して、低い有機相を窒素下の低有機相に移し、ヒュームフード内の複合有機相で溶媒を蒸発させます。
次に、窒素ガスの流れの下で脂質膜のチューブを閉じ、80°Cでサンプルを保存します。液体クロマトグラフィーの場合、抽出した脂質を63:35:5の500マイクロリットルで分離し、脂質膜と渦10秒間の間に、室温で10秒間、脂質膜と渦のチューブに対して、500マイクロリットルのアセト・ニトリル-2-プロパノールナノ純水混合物を混合した。ちょうど実証したように、渦あたり10秒間チューブを3回渦を回す前に、チューブの内容物を15分間超音波超音波処理にします。
24ウェルプレートに使用されるインサートでサンプル100マイクロリットルをガラスバイアルに移し、挿入物内の気泡を除去します。24ウェルプレートの1つのウェルに挿入物を入れ、逆相C18カラムCSHを液体クロマトグラフィーシステムに事前カラムに結合してロードします。カラム温度を摂氏55度、流量を毎分300マイクロリットルに設定します。
すべてのパラメータが設定されたら、最初のサンプルをロードする前に、抽出ブランクの10マイクロリットルをロードします。次いで、示されるように液体クロマトグラフィー勾配を用いて異なる脂質種を分離する。細胞から抽出された脂質に対するLC-MSデータからの代表的な総イオンクロマトグラムが生成される。
抽出した脂質の質量分析のために、熱いエレクトロスプレーイオン化イオン源を備えた質量分析計にサンプルをロードし、表に示すように分析パラメータを設定します。フーリエ変換アナライザーを使用して、60,000 の解像度で、質量範囲 150 ~ 2000 ダルトン内で MS-1 親イオンを検出します。次に、表に示された設定を用いてMS-2二次イオンを検出する。
広範なタンデムLC-MSファイルから異なる脂質を同定し、定量化するために、完全なスキャンMS-1データとデータ依存MS-2データを含むLC-MS生ファイルを無料で検索し、 未エステル化脂肪酸、カーディオ脂質、フィトセリミド、フィトスフィゲンセン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチドロジノシトール、ホスファチドルセリン、トリアシルグリセロール脂質クラスを用いた質量を使用して質量を使用し、100万個のイオンおよび100万個の製品に対して100万個の製品に対して100万個あたりの5部の電荷許容範囲で割った。次に、ソフトウェアユーザーマニュアルに記載されている指示に従って、異常な脂肪酸組成を有する内部脂質基準および脂質種を同定する。この高感度タンデムLC-MS法により、1マイクロリットル当たり0.165ピコモラーの低濃度での脂質の分子種の同定と定量が可能です。
この定量の限界は、広範囲の濃度内の異なる脂質クラスとは異なります。この方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析のための代替移動相添加剤を使用することにより、脂質のイオン化の効率を高めるために使用することができます。これらの代替移動相添加剤のそれぞれは、通常の位相と逆相LCカラムの両方に使用することができます。
衝突誘発解離法は、電気噴霧イオン化ネガティブモードの質量分析に対する酢酸アンモニウム移動相添加剤と組み合わせて使用すれば有益であり、これらの条件下で、MS-2製品へのMS-1脂質イオン断片化の効率を高めることができる。これに対して、高エネルギー、衝突解離法は、これらの条件下での電子スプレーイオン化陽性モードの電気スプレーイオン化陽性モードに対するアンモニウム・ギドメ移動相添加剤と併用すれば有利であり、MS-2製品へのMS-1脂質イオン断片化の効率の向上を可能にする。有機相を採取する際は、相を混ぜないでください。
窒素ガスの流れの下でチューブを閉じます。挿入内のバブルを除去し、正しい方向に列を接続します。LC-MSではピークの同一性を判断できない場合、MS-NMRを使用してその分子の構造を推測することができます。
