このプロトコルは、ヒトの歯科上皮細胞を調達するための強化された方法を実証する。手順中に凝集細胞ペレットを同定することは困難である。上清を扱う際は、細胞の母集団の損失を防ぐために注意してください。
まず、影響を受けた第三大臼歯の外科的抽出中に歯包を収穫する。細胞分離手順を開始するか、3%ペニシリンストレプトマイシンとDPBSで摂氏4度で歯包を保存します。歯の卵胞を洗うためには、歯包をピンセットで持ち、洗浄管1に入れる。
10~15回軽く振ります。それを取り出し、チューブ2に入れてください。もう一度、それを10〜15回振ります。
最後に、それを取り出し、チューブ3に入れて、それを振ります。3回洗浄した後、60ミリメートルの培養皿に歯包を入れます。歯の卵胞がパルピーまたはスクイーズな外観を持つまで、組織はさみで組織をミンチ。
培養皿の小さな側部を使用して、組織の損失を最小限に抑えます。コラゲターゼタイプ1とプロテアーゼ溶液を15ミリリットルの円錐チューブにそれぞれ1ミリリットル混ぜます。みじん切り組織を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、穏やかに振り、摂氏37度で1時間インキュベートします。
0.05%トリプシン-EDTAの5ミリリットルをチューブに加えます。それを振り、摂氏37度で15分間インキュベートします。ケラチノサイトを含むケラチノサイト培地と10%のウシ胎児血清を調製する。
ケラチノサイト培地を新しい50ミリリットル円錐形チューブに3ミリリットル加えます。このチューブの上に40マイクロメートルのストレーナーを置きます。次に、10ミリリットルの血清ピペットを用いて組織を含む管から上清を吸引し、ストレーナーを通す。
収集した懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。チューブを遠心分離し、上清を取り除く。その後、ケラチノサイトの血清フリー培地を3ミリリットル添加する。
さらに3分間遠心分離機を取り出し、上清を取り除きます。ケラチノサイト無血清培地を用いて、単一細胞集団を60ミリメートルの培養皿に盛り付けます。37°Cで5%の二酸化炭素の加湿雰囲気の中で5ミリリットルの最終的な量で培養皿を維持します。
上皮形態を有する細胞は、単一細胞集団をめっきしてから7〜10日以内に現れた。石畳の形をした上皮細胞の数は、出現時に1から10まで及び、細胞は時間の経過とともにコロニーに拡大した。最も重要なステップは、小さな粒子に歯包をミンチすることです。
それは卵胞組織からの単一細胞の分離を高める。間葉細胞は、ヒトの歯包から単離することができる。培養環境を含む血清は間葉系細胞を選択し、単一細胞集団からの上皮増殖を阻害する。
このプロトコルは、ヒトの歯科上皮細胞を調達する方法を提供する。歯包由来上皮細胞は、歯科上皮間葉間葉相互作用の研究に利用することができる。
