Die Folgen von Mutationen auf die Genexpression werden oft qualitativ durch In-situ-Hybridisierung bewertet und im Allgemeinen visuell bewertet, was subjektiv und von den Erwartungen des Forschers voreingenommen ist. Diese Methode bietet eine konsistentere Möglichkeit, In-situ-Experimente zu vergleichen, indem Bildintensitäten quantifiziert und diese Verzerrung entfernt wird. Dies kann auch leicht an andere Modellsysteme angepasst werden, die in situ Hybridisierung als Leser einer Genexpression verwenden.
Beginnen Sie mit der Abbildung der In-situ-Hybridisierungs- oder ISH-gefärbten Embryonen. Bereiten Sie eine Glycerinlösung vor und mischen Sie sie, um sie zu homogenisieren. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Drei-Milliliter-Pasteur-Pipette in die Glycerinlösung und lassen Sie sie sich mindestens fünf Minuten lang begnügen.
Bereiten und beschriften Sie genügend PCR-Röhren, um die ISH-gefärbten Embryonen nach der Bildgebung zu übertragen, und verwenden Sie dann eine Pasteurpipeette mit drei Millilitern, um 100% Glycerin an den Boden des Brunnens eines Glasdepressionsschlittens zu geben. Übertragen Sie einen einzelnen ISH-gebeizten Embryo auf das Glasschlitten und orientieren Sie ihn unter einem Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera und einer Boden- und Oberbeleuchtung ausgestattet ist. Passen Sie mit dem ersten Embryo die Beleuchtungs- und Belichtungszeit bei der gewünschten Vergrößerung an.
Bild so viele Embryonen wie erforderlich und beschriften Sie jedes Bild mit einer eindeutigen Zahl. Übertragen Sie nach der Bildgebung jeden Embryo in ein pcR-Rohr, das mit der gleichen Anzahl gekennzeichnet ist, und saugen Sie bei Bedarf das überschüssige Glycerin aus den PCR-Röhren an. Um die DNA zu extrahieren, fügen Sie 40 bis 75 Mikroliter eines alkalischen Lysepuffers wie HoTSHOT zu jeder Röhre hinzu.
Die Rohre bei 95 Grad Celsius ca. 30 Minuten bebrüten und dann auf vier Grad Celsius abkühlen. Fügen Sie ein gleiches Volumen des Neutralisationspuffers hinzu und fahren Sie mit der Genotypisierung für die Mutation des Interesses fort. Um eine Bildanalyse durchzuführen, wählen Sie das Bild in Fidschi aus und öffnen Sie es, indem Sie auf Bearbeiten und dann inumlegen klicken, dann den Bildtyp in 8-Bit konvertieren, indem Sie auf die Registerkarte Bild klicken, Typ auswählen und 8-Bit auswählen.
Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus, und zeichnen Sie manuell den Interessenbereich oder ROI auf dem Bild um den Bereich, der das zu messende ISH-Signal enthält. Drücken Sie T, um den ROI-Manager zu öffnen und die Interessenregion auszuwählen, und klicken Sie dann auf Messen. Kopieren Sie den Mittelwert aus dem Ergebnisfenster in eine Kalkulationstabelle.
Um die Hintergrundintensität zu messen, verschieben Sie den ROI in eine Region im Embryo ohne Färbung, und klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen. Wählen Sie den Hintergrundbereich aus, und klicken Sie auf Messen, und notieren Sie dann den mittleren Intensitätswert in der Kalkulationstabelle. Erhalten Sie die mittlere Pixelintensität des NC2-Hybridisierungssignals, indem Sie die mittlere Intensität des Hintergrunds von der des gebeizten Bereichs subtrahieren.
Nachdem Sie die mittlere Pixelintensität jeder Probe ermittelt haben, weisen Sie jeder Probe einen Genotyp zu. Wenn der Genotyp nicht bestimmt werden kann, schließen Sie die Probe von der nachfolgenden Analyse aus. Sortieren Sie die mittleren Probenintensitätswerte nach Genotyp und führen Sie statistische Tests durch.
Der Nutzen dieser Technik wurde auf der ISH für dnmt3bb demonstriert. 1 in Embryonen aus einem runx1 heterozygoten Incross. Ein Rückgang der dnmt3bb.
1 Expression wurde bei Runx1 homozygoten Mutanten nachgewiesen, während heterozygote Embryonen keine signifikanten Unterschiede in dnmt3bb zeigten. 1 Ausdruck. Bei dem Versuch, die Wirkung der Lmo4-Mutation auf die Runx1-Expression zu bestimmen, zeigte diese Analyse keine signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen Wildtyp und homozygoten Lmo4-Mutanten.
Eine kleine Abnahme der Runx1-Expression wurde jedoch durch einzelne Embryo qPCR festgestellt. Bei etwa 0,4% der runx1-sonsierten Embryonen hatte die ISH einen hohen Hintergrund, der zu einer negativen Zahl führte, wenn sie vom Signal subtrahiert wurde. In solchen Fällen wurden die Embryonen von der Analyse ausgeschlossen.
Vier verschiedene Regionen an den Embryonen wurden getestet, um Hintergrundkorrekturen zu optimieren. Während es in einem der Hintergrundbereiche einen relativ stabilen Unterschied in der Intensität des ROI gab, zeigte R3 immer eine höhere Intensität als der ROI und sollte nicht für die Hintergrundkorrektur verwendet werden. R1 und R4 erwiesen sich als die am besten geeigneten Bereiche für die Hintergrundkorrektur.
Es ist wichtig, die besten Bedingungen für die Bildgebung zu finden und sie während des gesamten Experiments unverändert zu halten. Wir empfehlen auch, die Pixelintensität zu quantifizieren, bevor jeder Probe ein Genotyp zugewiesen wird.
