유전자 발현에 돌연변이의 결과는 수시로 현장에서 혼성화에 의해 질적으로 평가되고 일반적으로 연구원의 기대에 의해 주관적이고 편향되는 시각적으로 득점됩니다. 이 방법은 이미지 강도를 정량화하여 시투 실험에서 비교할 수 있는 보다 일관된 방법을 제공하고 해당 바이어스를 제거합니다. 이것은 또한 유전자 발현의 판독기로 시상 혼성화에서 사용하는 다른 모델 시스템에 쉽게 적응될 수 있다.
시상 혼성화 또는 ISH 염색 배아를 이미징하여 시작합니다. 글리세롤 용액을 준비하고 혼합하여 균질화합니다. 3 밀리리터 파스퇴르 파이펫으로 글리세롤 용액으로 배아를 옮기고 적어도 5분 동안 정착하게 한다.
이미징 후 ISH 스테인드 배아를 전송하기에 충분한 PCR 튜브를 준비하고 라벨을 붙인 다음 3밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 유리 우울증 슬라이드의 우물 바닥에 100% 글리세롤을 추가합니다. 단일 ISH 스테인드 배아를 유리 슬라이드로 옮기고 디지털 카메라와 바닥 및 상단 조명이 장착된 스테레오 현미경으로 방향을 지정합니다. 첫 번째 배아를 사용하여 원하는 배율에서 조명 및 노출 시간을 조정합니다.
필요에 따라 많은 배아를 이미지화하고 각 이미지에 고유한 번호로 레이블을 지정합니다. 이미징 후 각 배아를 동일한 번호로 표시된 PCR 튜브로 옮기고 필요한 경우 PCR 튜브에서 과도한 글리세롤을 흡인시합니다. DNA를 추출하려면 각 튜브에 HoTSHOT과 같은 알칼리성 리시스 버퍼의 40~75마이크로리터를 추가합니다.
약 30분 동안 95도의 튜브를 배양한 다음 섭씨 4도로 식힙니다. 동일한 양의 중화 버퍼를 추가하고 관심 있는 돌연변이를 위한 유전화를 진행합니다. 이미지 분석을 수행하려면 피지에서 이미지를 선택하고 열고 편집을 클릭한 다음 반전한 다음 이미지 탭을 클릭하고 Type을 선택하고 8비트를 선택하여 이미지 유형을 8비트로 변환합니다.
다각형 도구를 선택하고 측정할 ISH 신호를 포함하는 영역 주위의 이미지에 관심 영역 또는 ROI영역을 수동으로 그립니다. T를 눌러 ROI 관리자를 열고 관심 영역을 선택한 다음 측정값을 클릭합니다. 결과 창에서 스프레드시트에 평균 값을 복사합니다.
배경 강도를 측정하려면 ROI를 염색하지 않고 배아의 영역으로 이동하고 ROI 관리자에 추가를 클릭합니다. 백그라운드 영역을 선택하고 측정값을 클릭한 다음 스프레드시트에서 평균 강도 값을 기록합니다. 스테인드 영역의 배경의 평균 강도를 빼서 NC2 혼성화 신호의 평균 픽셀 강도를 가져옵니다.
모든 샘플의 평균 픽셀 강도를 결정한 후 각 샘플에 유전자형을 할당합니다. 유전자형을 확인할 수 없는 경우 후속 분석에서 샘플을 제외합니다. 유전자형에 따라 평균 표본 강도 값을 정렬하고 통계 테스트를 진행합니다.
이 기술의 유용성은 dnmt3bb에 대한 ISH에서 입증되었습니다. runx1 이종구우스 크로스에서 배아에서 1. dnmt3bb의 감소.
1 발현은 runx1 homozygous 돌연변이체에서 검출되었으며 이종화 구균 배아는 dnmt3bb에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 식 1개. lmo4 돌연변이가 runx1 발현에 미치는 영향을 확인하려고 시도할 때, 이 분석은 야생 유형과 호모니구스 lmo4 돌연변이체 사이의 표정에 상당한 차이를 나타내지 않았다.
그러나, runx1 발현의 작은 감소는 단일 배아 qPCR에 의해 검출되었다. runx1 프로브 배아의 약 0.4%에서 ISH는 신호에서 빼졌을 때 음수의 결과로 높은 배경을 가지고 있었습니다. 이러한 경우, 배아는 분석에서 제외되었다.
배아의 4개의 다른 지구는 배경 보정을 낙낙하기 위하여 시험되었습니다. 배경 영역에서 ROI의 강도가 상대적으로 안정적인 차이가 있었지만 R3는 항상 ROI보다 높은 강도를 보였으며 배경 보정에 사용해서는 안됩니다. R1 과 R4는 배경 보정에 가장 적합한 영역으로 입증되었습니다.
이미징을 위한 최상의 조건을 찾고 실험 전반에 걸쳐 변경되지 않는 유지하는 것이 중요합니다. 또한 각 샘플에 유전자형을 할당하기 전에 픽셀 강도를 정량화하는 것이 좋습니다.
