As consequências das mutações na expressão genética são frequentemente avaliadas qualitativamente pela hibridização in situ e geralmente pontuadas visualmente, o que é subjetivo e tendencioso pelas expectativas do pesquisador. Este método fornece uma maneira mais consistente de comparar experimentos in situ quantificando intensidades de imagem e remove esse viés. Isso também pode ser facilmente adaptado a outros sistemas de modelos que usam a hibridização in situ como leitor de uma expressão genética.
Comece por imagem dos embriões in situ hibridização ou ISH manchados. Prepare uma solução de glicerol e misture-a para homogeneizar. Transfira os embriões para a solução de glicerol com uma pipeta Pasteur de três mililitros e deixe-os se contentarem por pelo menos cinco minutos.
Prepare e rotule tubos PCR suficientes para transferir os embriões manchados de ISH após a imagem, em seguida, use uma pipeta Pasteur de três mililitros para adicionar 100% glicerol ao fundo do poço de um slide de depressão de vidro. Transfira um único embrião manchado de ISH para o slide de vidro e oriente-o sob um microscópio estéreo equipado com uma câmera digital e iluminação inferior e superior. Utilizando o primeiro embrião, ajuste o tempo de iluminação e exposição na ampliação desejada.
Imagem quantos embriões necessários e rotule cada imagem com um número único. Após a imagem, transfira cada embrião para um tubo PCR rotulado com o mesmo número e, se necessário, aspire o excesso de glicerol dos tubos PCR. Para extrair o DNA, adicione 40 a 75 microliters de um tampão alcalino de lise, como o HoTSHOT, a cada tubo.
Incubar os tubos a 95 graus Celsius por aproximadamente 30 minutos e depois esfriá-los a quatro graus Celsius. Adicione um volume igual de tampão de neutralização e proceda com genotipagem para a mutação de interesse. Para realizar a análise da imagem, selecione e abra a imagem em Fiji e inverta-a clicando em Editar e, em seguida, inverter, em seguida, converta o tipo de imagem em 8 bits clicando na guia Imagem, selecionando Tipo e selecionando 8 bits.
Selecione a ferramenta polígono e desenhe manualmente a região de interesse ou ROI na imagem ao redor da região que contém o sinal ISH a ser medido. Pressione T para abrir o Gerenciador de ROI e selecione a região de interesse e clique em Medir. Copie o valor médio da janela Resultados para uma planilha.
Para medir a intensidade de fundo, mova o ROI para uma região no embrião sem coloração e clique em Adicionar no Gerenciador de ROI. Selecione a região de fundo e clique em Medir e, em seguida, registo o valor médio de intensidade na planilha. Obtenha a intensidade média do pixel do sinal de hibridização NC2 subtraindo a intensidade média do fundo da região manchada.
Depois de determinar a intensidade média do pixel de cada amostra, atribua um genótipo a cada amostra. Se o genótipo não puder ser determinado, exclua a amostra da análise subsequente. Classifique os valores médios de intensidade da amostra de acordo com o genótipo e prossiga com testes estatísticos.
A utilidade desta técnica foi demonstrada no ISH para dnmt3bb. 1 em embriões de um runx1 heterozigoso incross. Uma diminuição no dnmt3bb.
1 expressão foi detectada em mutantes homozigos runx1, enquanto embriões heterozigos não apresentaram diferenças significativas no dnmt3bb. 1 expressão. Ao tentar determinar o efeito da mutação LMO4 na expressão runx1, esta análise não mostrou diferenças significativas na expressão entre tipo selvagem e mutantes imo4 homozigos.
No entanto, uma pequena diminuição na expressão runx1 foi detectada por um único embrião qPCR. Em cerca de 0,4% dos embriões sondados por Runx1, o ISH tinha um fundo alto que resultou em um número negativo quando foi subtraído do sinal. Nesses casos, os embriões foram excluídos da análise.
Quatro regiões diferentes nos embriões foram testadas para otimizar correções de fundo. Embora tenha havido uma diferença relativamente estável na intensidade do ROI em qualquer uma das áreas de fundo, o R3 sempre apresentou maior intensidade que o ROI e não deve ser usado para correção de fundo. R1 e R4 provaram ser as áreas mais apropriadas para correção de fundo.
É importante encontrar as melhores condições para a imagem e mantê-las inalteradas durante todo o experimento. Também recomendamos quantificar a intensidade do pixel antes de atribuir um genótipo a cada amostra.
