Les conséquences des mutations sur l’expression des gènes sont souvent évaluées qualitativement par hybridation in situ et généralement notées visuellement, ce qui est subjectif et biaisé par les attentes du chercheur. Cette méthode fournit un moyen plus cohérent de comparer les expériences in situ en quantifiant les intensités d’image et supprime ce biais. Cela peut également être facilement adapté à d’autres systèmes modèles qui utilisent l’hybridation in situ comme lecteur d’une expression génétique.
Commencez par l’imagerie des embryons tachés d’hybridation in situ ou d’ISH. Préparer une solution de glycérol et la mélanger pour homogénéiser. Transférez les embryons à la solution glycérol avec une pipette Pasteur de trois millilitres et laissez-les se contenter d’au moins cinq minutes.
Préparez et étiquetez suffisamment de tubes PCR pour transférer les embryons tachés d’ISH après l’imagerie, puis utilisez une pipette Pasteur de trois millilitres pour ajouter 100% glycérol au fond du puits d’une glissade de dépression de verre. Transférez un seul embryon taché d’ISH sur la lame de verre et orientez-le sous un microscope stéréo équipé d’un appareil photo numérique et d’un éclairage inférieur et supérieur. À l’aide du premier embryon, ajustez l’éclairage et le temps d’exposition au grossissement désiré.
Imagez autant d’embryons que nécessaire et étiquetez chaque image avec un nombre unique. Après l’imagerie, transférer chaque embryon dans un tube PCR étiqueté avec le même nombre et, si nécessaire, aspirer l’excès de glycérol des tubes PCR. Pour extraire l’ADN, ajouter 40 à 75 microlitres d’un tampon de lyse alcaline tel que HoTSHOT à chaque tube.
Incuber les tubes à 95 degrés Celsius pendant environ 30 minutes, puis les refroidir à quatre degrés Celsius. Ajoutez un volume égal de tampon de neutralisation et procédez au génotypage pour la mutation d’intérêt. Pour effectuer l’analyse d’image, sélectionnez et ouvrez l’image aux Fidji et inversionz-la en cliquant sur Modifier puis Inversez, puis convertissez le type d’image en 8 bits en cliquant sur l’onglet Image, en sélectionnant type et en sélectionnant 8 bits.
Sélectionnez l’outil polygone et dessinez manuellement la région d’intérêt ou le retour sur investissement sur l’image autour de la région qui contient le signal ISH à mesurer. Appuyez sur T pour ouvrir le gestionnaire de roi et sélectionner la région d’intérêt, puis cliquez sur Mesurer. Copiez la valeur moyenne de la fenêtre Résultats à une feuille de calcul.
Pour mesurer l’intensité de l’arrière-plan, déplacez le retour sur investissement vers une région de l’embryon sans coloration et cliquez sur Ajouter dans le gestionnaire de retour sur investissement. Sélectionnez la région d’arrière-plan et cliquez sur Mesurer, puis enregistrez la valeur d’intensité moyenne dans la feuille de calcul. Obtenez l’intensité moyenne des pixels du signal d’hybridation NC2 en soustrayant l’intensité moyenne de l’arrière-plan de celle de la région tachée.
Après avoir déterminé l’intensité moyenne des pixels de chaque échantillon, attribuez un génotype à chaque échantillon. Si le génotype ne peut pas être déterminé, exclure l’échantillon de l’analyse ultérieure. Trier les valeurs moyennes d’intensité de l’échantillon en fonction du génotype et procéder à des tests statistiques.
L’utilité de cette technique a été démontrée sur ISH pour dnmt3bb. 1 dans les embryons d’un runx1 hétérozygotes incross. Une diminution de dnmt3bb.
1 expression a été détectée chez les mutants homozygotes runx1 tandis que les embryons hétérozygotes n’ont montré aucune différence significative dans dnmt3bb. 1 expression. En essayant de déterminer l’effet de la mutation lmo4 sur l’expression runx1, cette analyse n’a pas montré de différences significatives dans l’expression entre le type sauvage et les mutants homozygous lmo4.
Cependant, une petite diminution de l’expression runx1 a été détectée par qPCR d’embryon simple. Dans environ 0,4 % des embryons sondés par runx1, l’ISH avait un fond élevé qui a donné lieu à un nombre négatif lorsqu’il a été soustrait du signal. Dans de tels cas, les embryons ont été exclus de l’analyse.
Quatre régions différentes sur les embryons ont été testées pour optimiser les corrections de fond. Bien qu’il y ait eu une différence relativement stable dans l’intensité du retour sur investissement dans l’une ou l’autre des zones de fond, R3 a toujours montré une intensité plus élevée que le retour sur investissement et ne devrait pas être utilisé pour la correction de fond. R1 et R4 se sont avérés être les domaines les plus appropriés pour la correction des antécédents.
Il est important de trouver les meilleures conditions pour l’imagerie et de les garder inchangées tout au long de l’expérience. Nous recommandons également de quantifier l’intensité des pixels avant d’attribuer un génotype à chaque échantillon.
